Specific cyclic ADP-ribose phosphohydrolase obtained by mutagenic engineering of Mn2+-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase

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Specific cyclic ADP-ribose phosphohydrolase obtained by mutagenic engineering of Mn2+-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase

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Title: Specific cyclic ADP-ribose phosphohydrolase obtained by mutagenic engineering of Mn2+-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase
Author: Ribeiro, João Nuno Meireles da Silva Gonçalves; Canales García, José; Cabezas Martín, Alicia; Rodrigues, Joaquim Rui de Castro; Pinto Corraliza, Rosa María; López Villamizar, Iralis; Costas Vázquez, María Jesús; Cameselle Viña, José Carlos
Abstract: La ribosa ADP cíclica (cADPR) es un mensajero para la movilización de Ca2+. Se cree que su rotación se produce por glicohidrolisis a ADP-ribosa. Sin embargo, la ADP-ribosa/CDP-difosfatasa alcohólica (ADPRibase-Mn) actúa como fosfhidrolasa cADPR con una eficiencia mucho menor que en sus principales sustratos. Recientemente, demostramos que la mutagénesis de la ADPRibasa-Mn humana en Phe37, Leu196 y Cys253 altera su especificidad: el mejor sustrato de la mutante F37A + L196F + C253A es el cADPR por una diferencia corta, siendo la mutación Cys253 esencial para la preferencia del cADPR. Su proximidad a la ribosa "norte" del cADPR en los modelos de acoplamiento indica que Cys253 es una restricción estérica para el posicionamiento del cADPR. Con el objetivo de obtener una fosfohidrolasa específica del cADPR, se probaron nuevas mutaciones en Asp250, Val252, Cys253 y Thr279, todas ellas cerca de la ribosa 'norte'. En primer lugar, la mutante F37A + L196F + C253G, con un residuo más pequeño 253 (Ala > Gly), mostró una mayor especificidad del cADPR. Luego, el mutante F37A + L196F + V252A + C253G, con otro residuo más pequeño (Val > Ala), mostró la especificidad deseada, con el cADPR kcat/KM ≈20-200 veces más grande que para cualquier otro sustrato. Cuando se probó en mezclas de nucleótidos, el cADPR se agotó mientras que otros permanecieron inalterados. Sugerimos que la fosfhidrolasa específica del cADPR, por transgénesis celular u orgánica, o las mutaciones diseñadas, por edición del genoma, ofrecen oportunidades para estudiar el efecto del agotamiento del cADPR en los muchos sistemas en los que interviene.Cyclic ADP-ribose (cADPR) is a messenger for Ca2+ mobilization. Its turnover is believed to occur by glycohydrolysis to ADP-ribose. However, ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase (ADPRibase-Mn) acts as cADPR phosphohydrolase with much lower efficiency than on its major substrates. Recently, we showed that mutagenesis of human ADPRibase-Mn at Phe37, Leu196 and Cys253 alters its specificity: the best substrate of the mutant F37A + L196F + C253A is cADPR by a short difference, Cys253 mutation being essential for cADPR preference. Its proximity to the ‘northern’ ribose of cADPR in docking models indicates Cys253 is a steric constraint for cADPR positioning. Aiming to obtain a specific cADPR phosphohydrolase, new mutations were tested at Asp250, Val252, Cys253 and Thr279, all near the ‘northern’ ribose. First, the mutant F37A + L196F + C253G, with a smaller residue 253 (Ala > Gly), showed increased cADPR specificity. Then, the mutant F37A + L196F + V252A + C253G, with another residue made smaller (Val > Ala), displayed the desired specificity, with cADPR kcat/KM ≈20–200-fold larger than for any other substrate. When tested in nucleotide mixtures, cADPR was exhausted while others remained unaltered. We suggest that the specific cADPR phosphohydrolase, by cell or organism transgenesis, or the designed mutations, by genome editing, provide opportunities to study the effect of cADPR depletion on the many systems where it intervenes.
URI: http://hdl.handle.net/10662/10629
Date: 2018


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