Funciones de los nanodominios asociados a las balsas lipídicas de la membrana plasmática de neuronas en la regulación y coordinación de la señalización por calcio y por especies reactivas del oxígeno y sus implicaciones para la excitabilidad y supervivencia neuronal

Abstract

Una alteración sostenida de la homeostasis intracelular del calcio y un incremento sostenido del estrés oxidativo celular son puntos convergentes en los procesos neurodegenerativos prevalentes actualmente. En esta tesis se ha puesto de manifiesto la relevancia para el control de la homeostasis del calcio citosólico en las neuronas granulares del cerebelo de rata (CGN) de los sistemas de transporte del calcio asociados a los “rafts” lipídicos utilizando metil-β-ciclodextrina (MβCD). El tratamiento con MβCD de las CGN maduras produjo una disminución de los niveles de fosforilación de la subunidad β de los canales de calcio de tipo L (LTCC) y su inactivación. Un efecto similar se alcanzó con el tratamiento con inhibidores de dos proteínas quinasas asociadas con los “rafts”, concluyéndose que su disrupción genera LTCC disfuncionales. Adicionalmente, se ha demostrado que estos nanodominios experimentan un notable incremento durante la maduración de las CGN y contribuyen significativamente a la producción total de ROS/RNS en los cultivos primarios de CGN “in vitro”, con una importante contribución de la isoforma 3 de la citocromo b₅ reductasa al control de la producción total de ROS en CGN maduras. Se ha mostrado la implicación de los sistemas de transporte del calcio asociados a estos nanodominios en la elevación sostenida de la concentración del calcio citosólico inducida por concentraciones neurotóxicas de la rotenona y que la creatina protege contra la desregulación de la homeostasis del calcio citosólico inducida por rotenona, que precede a la despolarización mitocondrial y al incremento del estrés oxidativo en este proceso neurotóxico.

A sustained alteration of intracellular calcium homeostasis and a sustained increase in cellular oxidative stress are convergent points in the neurodegenerative processes prevalent nowadays. In this Ph.D. work it has been shown the relevance for the control of cytosolic calcium homeostasis in rat cerebellar granule neurons (CGN) of calcium transport systems associated with lipid rafts using methyl-β-cyclodextrin (MβCD). MβCD-induced rafts disruption of mature CGN lowered the levels of LTCC´s β-subunit phosphorylation and these calcium channels were inactivated. A similar result was obtained with mature CGN treatment with inhibitors of two protein kinases associated with these rafts, leading to the conclusion that lipid rafts disruption produce dysfunctional LTCCs. Additionally, it is demonstrated that during CGN maturation these nanodomains increase more than two-fold and afford a significant contribution to the overall ROS/RNS production in primary cultures of CGN “in vitro”, with the isoform 3 of cytochrome b₅ reductase playing a major role in the control of the overall ROS production in mature CGN. It is also shown the involvement of calcium transport systems associated with these nanodomains in the sustained raise of cytosolic calcium induced by neurotoxic concentrations of rotenone, and that creatine protects against rotenone-induced dysregulation of cytosolic calcium homeostasis. The results also show that the sustained raise of cytosolic calcium concentration precedes the mitochondrial membrane depolarization and the raise of ROS that generates the oxidative stress in rotenone neurotoxicity.