Validación de técnicas para el desarrollo de un sistema multidiagnóstico de la leishmaniosis visceral por leishmania infantum

Abstract

El diagnóstico de la leishmaniosis canina (L. Can) por Leishmania infamtum, es complejo por el largo periodo de incubación, la existencia de portadores inaparentes capaces de trasmitir el parásito a los vectores y por la necesidad de utilizar diferentes técnicas diagnósticas, inmunológicas y moleculares, para la detección precoz. Los objetivos generales planteados fueron: a) Validar las técnicas aplicadas al diagnóstico de la LCan, ELISA SLA IgG2, IFI y Real Time PCR (qPCR); b) desarrollar un sistema de diagnóstico múltiple para la detección y seguimiento de perros infectados por L. infantum. Para la validación de ELISA SLA IgG2 e IFI, se utilizaron muestras de suero sanguíneo procedentes de 116, y 96 perros respectivamente y para qPCR, 44 muestras de médula ósea y ganglio linfático. Se estudiaron los atributos linealidad, exactitud, especificidad, sensibilidad, precisión, límite de detección y cuantificación, robustez y estabilidad. Para la consecución del segundo objetivo, se ha desarrollado un sistema de diagnóstico múltiple utilizando muestras no invasivas, pelo, hisopados (cerumen-mucosas-piel) y sangre seca adherida a papel Whatman, cuyo dosier se incluye en esta Tesis Doctoral y cuyos resultados de aplicación, se discuten mediante dos artículos publicados. Se evidencia que nuestros métodos diagnósticos estandarizados, ELISA, IFI y qPCR, son altamente fiables, sensibles y específicos. Estas técnicas han servido de referencia para el desarrollado MultiLeish 5D, un sistema de diagnóstico múltiple para la detección y seguimiento de la LCan, que permite a los profesionales veterinarios el diagnóstico en las diferentes fases y estados de la patocronia, primoinfectados, latentes evolutivos y patentes.

Leishmaniosis canine (L.Can) diagnosis is complex because of the extensive incubation period, the existence of silent carriers which can spread the parasite through vector insects, and because of the need to use different diagnostic, immunologic and molecular techniques for an early detection. General objectives were a) validate the applied L. Can diagnostic techniques, namely SLA IgG2 ELISA, IFAT and Real Time PCR (qPCR); and b) To develop a Multiple Diagnosis System for the detention and follow ups of dogs infected by L. infantum. For the evaluation of techniques SLA IgG2 ELISA and IFAT were analysed samples of blood serum of 116 and 96 dogs respectively, for qPCR bone marrow and lymph nodes of 44 dog. Attributes of linearity, exactitude, specificity, sensitivity, precision, detection limits, robustness and stability were studied. For the attainment of the second objective, a multiple diagnosis system has been developed, which using non-invasive samples, hair, or those obtained through cotton swab (cerumen-mucosa-skin) and, dried blood on Whatman’s paper. A dossier is included in this PhD report and results of which are discussed in two published articles. It is shown that our standardized, diagnostic methods (ELISA, IFAT and qPCR) are highly reliable, sensitive and specific. These techniques have been used as reference for the development of Multileish 5D, a Multiple Diagnosis System for the detection and follow up of L. Can, which allows detection to professional veterinaries during the different stages and states of the pathocrony: primoinfected, latent and patent.