Effect of calcium, bicarbonate and albumin on capacitation-related events in equine sperm

Abstract

Repeatable methods for IVF have not been established in the horse, reflecting the failure of standard capacitating media to induce changes required for fertilization capacity in equine sperm. One important step in capacitation is membrane cholesterol efflux, which in other species is triggered by cholesterol oxidation and is typically enhanced using albumin as a sterol acceptor. We incubated equine sperm in the presence of calcium, BSA, and bicarbonate, alone or in combination. Bicarbonate induced an increase in reactive oxygen species (ROS) that was abolished by the addition of calcium or BSA. Bicarbonate induced protein tyrosine phosphorylation (PY), even in the presence of calcium or BSA. Incubation at high pH enhanced PY but did not increase ROS production. Notably, no combination of these factors was associated with significant cholesterol efflux, as assessed by fluorescent quantitative cholesterol assay and confirmed by filipin staining. By contrast, sperm treated with methyl-b-cyclodextrin showed a significant reduction in cholesterol levels, but no significant increase in PYor ROS. Presence of BSA increased sperm binding to bovine zonae pellucidae in all three stallions. These results show that presence of serum albumin is not associated with a reduction in membrane cholesterol levels in equine sperm, highlighting the failure of equine sperm to exhibit core capacitation-related changes in a standard capacitating medium. These data indicate an atypical relationship among cholesterol efflux, ROS production, and PY in equine sperm. Our findings may help to elucidate factors affecting failure of equine IVF under standard conditions.

No se han establecido métodos repetibles para la FIV en el caballo, lo que refleja el fracaso de los medios capacitantes estándar para inducir los cambios necesarios para la capacidad de fertilización en los espermatozoides equinos. Un paso importante en la capacitación es el eflujo de colesterol de la membrana, que en otras especies se desencadena por la oxidación del colesterol y suele potenciarse utilizando albúmina como aceptor de esteroles. Incubamos espermatozoides equinos en presencia de calcio, BSA y bicarbonato, solos o combinados. El bicarbonato indujo un aumento de las especies reactivas del oxígeno (ROS) que fue abolido por la adición de calcio o BSA. El bicarbonato indujo la fosforilación de la proteína tirosina (PY), incluso en presencia de calcio o BSA. La incubación a pH elevado aumentó la PY pero no la producción de ROS. Notablemente, ninguna combinación de estos factores se asoció con un eflujo significativo de colesterol, evaluado mediante un ensayo cuantitativo fluorescente de colesterol y confirmado por tinción de filipina. Por el contrario, los espermatozoides tratados con metil-b-ciclodextrina mostraron una reducción significativa de los niveles de colesterol, pero no un aumento significativo de PY o ROS. La presencia de BSA aumentó la unión del esperma a la zonae pellucidae bovina en los tres sementales. Estos resultados demuestran que la presencia de albúmina sérica no está asociada a una reducción de los niveles de colesterol de membrana en los espermatozoides equinos, lo que pone de relieve la incapacidad de los espermatozoides equinos para mostrar cambios relacionados con la capacitación en un medio capacitante estándar.