Phosphoproteomics for the identification of new mechanisms of cryodamage: the role of SPATA18 in the control of stallion sperm function

Abstract

Although recent research has addressed the impact of cryopreservation on the stallion sperm proteome, studies addressing the stallion sperm phosphoproteome are lacking. In the present study, the data set of proteomes of fresh and cryopreserved spermatozoa were reanalyzed, showing that cryopreservation caused significant changes in the phosphoproteome. The phosphoproteins reduced most significantly by cryopreservation were Ca2+binding tyrosine phosphorylation regulated, protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (CABYR), mitochondria eating protein (SPATA18), A kinase anchoring protein 4 (AKAP4), A-kinase anchoring protein 3 (AKAP3) and the Family with sequence similarity 71 member B (FAM71B). These proteins belong to the gene ontology (GO) terms sperm fibrous sheath (GO: 0035686), and sperm principal piece (GO: 0097228). The regulatory interactions between kinases and phosphorylation sites on the proteins that were affected most were also investigated, and the potential kinases (based on human orthologs) involved in the regulation of these phosphoproteins identified were: PKCß for SPATA18 and GSK3ß for CABYR. Kinase inhibition assays were also conducted showing that kinases phosphorylating the above-mentioned proteins play an important role in their activity and thus, phosphorylation controls the activity of these proteins and their role in the regulation of the functionality and viability of stallion spermatozoa. In conclusion, the data reported here contribute to the understanding of the fact that the dephosphorylation of certain proteins is a molecular lesion induced by cryopreservation in the stallion spermatozoa.

Aunque investigaciones recientes han abordado el impacto de la criopreservación en el proteoma del esperma de semental, faltan estudios que aborden el fosfoproteoma del esperma de semental. En el presente estudio, se volvió a analizar el conjunto de datos de los proteomas de espermatozoides frescos y criopreservados, mostrando que la criopreservación causó cambios significativos en el fosfoproteoma. Las fosfoproteínas reducidas más significativamente por la criopreservación fueron Ca2+binding tyrosine phosphorylation regulated, protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (CABYR), mitochondria eating protein (SPATA18), A kinase anchoring protein 4 (AKAP4), A-kinase anchoring protein 3 (AKAP3) y la Family with sequence similarity 71 member B (FAM71B). Estas proteínas pertenecen a los términos de la ontología génica (GO) vaina fibrosa del espermatozoide (GO: 0035686), y pieza principal del espermatozoide (GO: 0097228). También se investigaron las interacciones reguladoras entre quinasas y sitios de fosforilación en las proteínas más afectadas, y las posibles quinasas (basadas en ortólogos humanos) implicadas en la regulación de estas fosfoproteínas identificadas fueron: PKCß para SPATA18 y GSK3ß para CABYR. También se realizaron ensayos de inhibición de cinasas que mostraron que las cinasas que fosforilan las proteínas mencionadas juegan un papel importante en su actividad y, por tanto, la fosforilación controla la actividad de estas proteínas y su papel en la regulación de la funcionalidad y viabilidad de los espermatozoides de semental.En conclusión, los datos aquí comunicados contribuyen a la comprensión del hecho de que la desfosforilación de ciertas proteínas es una lesión molecular inducida por la crioconservación en los espermatozoides de semental.