Transcriptome analysis reveals that fertilization with cryopreserved sperm downregulates genes relevant for early embryo development in the horse

Abstract

Artificial insemination with cryopreserved spermatozoa is a major assisted reproductive technology in many species. In horses, as in humans, insemination with cryopreserved sperm is associated with lower pregnancy rates than those for fresh sperm, however, direct effects of sperm cryopreservation on the development of resulting embryos are largely unexplored. The aim of this study was to investigate differences in gene expression between embryos resulting from fertilization with fresh or cryopreserved sperm. Embryos were obtained at 8, 10 or 12 days after ovulation from mares inseminated post-ovulation on successive cycles with either fresh sperm or frozen-thawed sperm from the same stallion, providing matched embryo pairs at each day. RNA was isolated from two matched pairs (4 embryos) for each day, and cDNA libraries were built and sequenced. Significant differences in transcripts per kilobase million (TPM) were determined using (i) genes for which the expression difference between treatments was higher than 99% of that in the random case (P < 0.01), and (ii) genes for which the fold change was � 2, to avoid expression bias in selection of the candidate genes. Molecular pathways were explored using the DAVID webserver, followed by network analyses using STRING, with a threshold of 0.700 for positive interactions. The transcriptional profile of embryos obtained with frozen-thawed sperm differed significantly from that for embryos derived from fresh sperm on all days, showing significant down-regulation of genes involved in biological pathways related to oxidative phosphorylation, DNA binding, DNA replication, and immune response. Many genes withreduced expression were orthologs of genes known to be embryonic lethal in mice. This study, for the first time, provides evidence of altered transcription in embryos resulting from fertilization with cryopreserved spermatozoa in any species. As sperm cryopreservation is commonly used in many species, including human, the effect of this intervention on expression of developmentally important genes in resulting embryos warrants attention.

La inseminación artificial con espermatozoides crioconservados es una importante tecnología de reproducción asistida en muchas especies. En los caballos, al igual que en los humanos, la inseminación con espermatozoides crioconservados se asocia con tasas de embarazo inferiores a las de los espermatozoides frescos; sin embargo, los efectos directos de la crioconservación de espermatozoides sobre el desarrollo de los embriones resultantes están en gran medida inexplorados. El objetivo de este estudio era investigar las diferencias en la expresión génica entre los embriones resultantes de la fecundación con esperma fresco o crioconservado. Se obtuvieron embriones a los 8, 10 ó 12 días de la ovulación de yeguas inseminadas tras la ovulación en ciclos sucesivos con semen fresco o semen congelado y descongelado del mismo semental, con lo que se obtuvieron parejas de embriones iguales cada día. Se aisló el ARN de dos pares emparejados (4 embriones) cada día y se crearon y secuenciaron bibliotecas de ADNc. Las diferencias significativas en transcritos por kilobase millón (TPM) se determinaron utilizando (i) genes para los que la diferencia de expresión entre tratamientos era superior al 99% de la del caso aleatorio (P < 0,01), y (ii) genes para los que el cambio de pliegue era � 2, para evitar el sesgo de expresión en la selección de los genes candidatos. Las vías moleculares se exploraron mediante el servidor web DAVID, seguido de análisis de redes mediante STRING, con un umbral de 0,700 para interacciones positivas. El perfil transcripcional de los embriones obtenidos con espermatozoides congelados y descongelados difería significativamente del de los embriones obtenidos con espermatozoides frescos en todos los días, mostrando una significativa regulación a la baja de genes implicados en vías biológicas relacionadas con la fosforilación oxidativa, la unión del ADN, la replicación del ADN y la respuesta inmunitaria. Muchos genes con expresión reducida eran ortólogos de genes conocidos por su letalidad embrionaria en ratones. Este estudio aporta, por primera vez, pruebas de la alteración de la transcripción en embriones resultantes de la fecundación con espermatozoides crioconservados en cualquier especie. Dado que la criopreservación de espermatozoides se utiliza habitualmente en muchas especies, incluida la humana, el efecto de esta intervención en la expresión de genes importantes para el desarrollo en los embriones resultantes merece atención.