Molecular Mechanisms Involved in the Impairment of Boar Sperm Motility by Peroxynitrite-Induced Nitrosative Stress

Abstract

Excessive levels of reactive nitrogen species (RNS) produce nitrosative stress. Among RNS are peroxynitrite, a highly reactive free radical generated when nitric oxide reacts with superoxide anion. Peroxynitrite effects have been mainly studied in somatic cells, and in spermatozoa the majority of studies are focused in humans. The aim of this study is to investigate the in vitro peroxynitrite effect on boar spermatozoa functions and the molecular mechanisms involved. Spermatozoa were exposed to the donor 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) in non-capacitating or capacitating medium, motility was evaluated by CASA, functional parameters by flow cytometry and sperm protein phosphorylation by Western blotting. SIN-1 treatment, that significantly increases peroxynitrite levels in boar spermatozoa, potentiates the capacitating -stimulated phosphorylation of PKA substrates and GSK-3α. SIN-1 induced peroxynitrite does not decrease sperm viability, but significantly reduces sperm motility, progressive motility, velocities and motility coefficients. Concomitantly, peroxynitrite does not affect mitochondrial membrane potential, plasma membrane fluidity or A23187-induced acrosome reaction. However, peroxynitrite significantly increases sperm lipid peroxidation in both media. In conclusion, peroxynitrite compromises boar sperm motility without affecting mitochondrial activity. Although peroxynitrite potentiates the phosphorylation of pathways leading to sperm motility, it also causes oxidative stress that might explain, at least partially, the motility impairment.

Los niveles excesivos de especies reactivas de nitrógeno (RNS) producen estrés nitrosativo. Entre los RNS se encuentra el peroxinitrito, un radical libre altamente reactivo que se genera cuando el óxido nítrico reacciona con el anión superóxido. Los efectos de los peroxinitritos se han estudiado principalmente en células somáticas, y en los espermatozoides la mayoría de los estudios se centran en seres humanos. El objetivo de este estudio es investigar el efecto in vitro de los peroxinitritos sobre las funciones de los espermatozoides de jabalí y los mecanismos moleculares involucrados. Los espermatozoides fueron expuestos a la 3-morfolinosindnonimina (SIN-1) donante en medio no capacitante o capacitante, la motilidad fue evaluada por CASA, los parámetros funcionales por citometría de flujo y la fosforilación de proteínas espermáticas por Western blotting. El tratamiento con SIN-1, que aumenta significativamente los niveles de peroxinitrito en los espermatozoides de jabalí, potencia la fosforilación estimulada por capacitantes de los sustratos PKA y GSK-3α. El peroxinitrito inducido por SIN-1 no disminuye la viabilidad espermática, pero reduce significativamente la motilidad espermática, la motilidad progresiva, las velocidades y los coeficientes de motilidad. Concomitantemente, el peroxinitrito no afecta el potencial de la membrana mitocondrial, la fluidez de la membrana plasmática o la reacción acrosómica inducida por el A23187. Sin embargo, el peroxinitrito aumenta significativamente la peroxidación lipídica de los espermatozoides en ambos medios. En conclusión, el peroxinitrito compromete la motilidad espermática del cerdo sin afectar la actividad mitocondrial. Aunque el peroxinitrito potencia la fosforilación de las vías que conducen a la motilidad de los espermatozoides, también causa estrés oxidativo que podría explicar, al menos parcialmente, el deterioro de la motilidad.