Melatonin induces reactive oxygen species generation and changes in glutathione levels and reduces viability in human pancreatic stellate cells

Abstract

En este estudio, se han examinado los efectos de concentraciones farmacológicas de melatonina (1 μM-1 mM) en células estrelladas pancreáticas humanas (HPSCs). Los marcadores específicos del tipo celular y la expresión de los receptores de melatonina se analizaron mediante western blot. Los cambios en la concentración intracelular de Ca2+ libre se siguieron mediante análisis fluorimétrico de células cargadas con fura-2. Los niveles de glutatión reducido (GSH) y glutatión oxidado (GSSG) se determinaron mediante técnicas de fluorescencia. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se monitorizó mediante 5-(y-6)-clorometil-2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato éster de acetilo y fluorescencia derivada de MitoSOX™ Red. La viabilidad celular se estudió mediante el ensayo AlamarBlue®. Las células cultivadas expresaron marcadores típicos de las células estrelladas. Sin embargo, no se pudieron detectar receptores de membrana celular para la melatonina. La tripsigargina, la bradiquinina o la melatonina indujeron cambios en la concentración intracelular de Ca2+ libre. En presencia del indol, se observó una disminución de la relación GSH/ GSSG que dependía de la concentración de melatonina utilizada. Además, el indol evocó un aumento dependiente de la concentración en la producción de ROS en las mitocondrias y en el citosol. Por último, la melatonina disminuyó la viabilidad de las HPSC de forma dependiente del tiempo y de la concentración. Concluimos que la melatonina, a concentraciones farmacológicas, induce cambios en el estado oxidativo de las HPSC. Esto podría regular la viabilidad celular y podría no implicar a receptores específicos de la membrana plasmática.

In this study, the effects of pharmacological concentrations of melatonin (1 μM–1 mM) on human pancreatic stellate cells (HPSCs) have been examined. Cell type–specific markers and expression of melatonin receptors were analyzed by western blot analysis. Changes in intracellular free Ca2+ concentration were followed by fluorimetric analysis of fura-2–loaded cells. Reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) levels were determined by fluorescence techniques. Production of reactive oxygen species (ROS) was monitored following 5-(and-6)-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester and MitoSOX™ Red–derived fluorescence. Cell viability was studied using the AlamarBlue® test. Cultured cells expressed markers typical of stellate cells. However, cell membrane receptors for melatonin could not be detected. Thapsigargin, bradykinin, or melatonin induced changes in intracellular free Ca2+ concentration. In the presence of the indole, a decrease in the GSH/ GSSG ratio was observed that depended on the concentration of melatonin used. Furthermore, the indole evoked a concentrationdependent increase in ROS production in the mitochondria and in the cytosol. Finally, melatonin decreased HPSC viability in a time and concentration-dependent manner. We conclude that melatonin, at pharmacological concentrations, induces changes in the oxidative state of HPSC. This might regulate cellular viability and could not involve specific plasma membrane receptors.