Negative Fgf8-Bmp2 feed-back is regulated by miR-130 during early cardiac specification

Abstract

It is known that secreted proteins from the anterior lateral endoderm, FGF8 and BMP2, are involved in mesodermal cardiac differentiation, which determines the first cardiac field, defined by the expression of the earliest specific cardiac markers Nkx-2.5 and Gata4. However, the molecular mechanisms responsible for early cardiac development still remain unclear. At present, microRNAs represent a novel layer of complexity in the regulatory networks controlling gene expression during cardiovascular development. This paper aims to study the role of miR130 during early cardiac specification. Our model is focused on developing chick at gastrula stages. In order to identify those regulatory factors which are involved in cardiac specification, we conducted gain- and loss-of-function experiments in precardiac cells by administration of Fgf8, Bmp2 and miR130, through in vitro electroporation technique and soaked beads application. Embryos were subjected to in situ hybridization, immunohistochemistry and qPCR procedures. Our results reveal that Fgf8 suppresses, while Bmp2 induces, the expression of Nkx-2.5 and Gata4. They also show that Fgf8 suppresses Bmp2, and vice versa. Additionally, we observed that Bmp2 regulates miR-130 -a putative microRNA that targets Erk1/2 (Mapk1) 3'UTR, recognizing its expression in precardiac cells which overlap with Erk1/2 pattern. Finally, we evidence that miR-130 is capable to inhibit Erk1/2 and Fgf8, resulting in an increase of Bmp2, Nkx-2.5 and Gata4. Our data present miR-130 as a necessary linkage in the control of Fgf8 signaling, mediated by Bmp2, establishing a negative feed-back loop responsible to achieve early cardiac specification.

Se sabe que las proteínas secretadas del endodermo lateral anterior, FGF8 y BMP2, están implicadas en la diferenciación cardíaca mesodérmica, que determina el primer campo cardíaco, definido por la expresión de los marcadores cardíacos específicos más tempranos Nkx-2.5 y Gata4. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables del desarrollo cardíaco temprano siguen sin estar claros. En la actualidad, los microARN representan una nueva capa de complejidad en las redes reguladoras que controlan la expresión génica durante el desarrollo cardiovascular. El objetivo de este trabajo es estudiar el papel de miR130 durante la especificación cardiaca temprana. Nuestro modelo se centra en el desarrollo del pollito en el estadio de gástrula. Para identificar los factores reguladores que intervienen en la especificación cardíaca, realizamos experimentos de ganancia y pérdida de función en células precardíacas mediante la administración de Fgf8, Bmp2 y miR130, a través de la técnica de electroporación in vitro y la aplicación de perlas empapadas. Los embriones fueron sometidos a procedimientos de hibridación in situ, inmunohistoquímica y qPCR. Nuestros resultados revelan que Fgf8 suprime, mientras que Bmp2 induce, la expresión de Nkx-2.5 y Gata4. También muestran que Fgf8 suprime Bmp2, y viceversa. Además, observamos que Bmp2 regula miR-130 -un microRNA putativo que se dirige a Erk1/2 (Mapk1) 3'UTR, reconociendo su expresión en células precardíacas que se solapan con el patrón de Erk1/2. Finalmente, evidenciamos que miR-130 es capaz de inhibir Erk1/2 y Fgf8, resultando en un incremento de Bmp2, Nkx-2.5 y Gata4. Nuestros datos presentan a miR-130 como un eslabón necesario en el control de la señalización de Fgf8, mediada por Bmp2, estableciendo un bucle de feed-back negativo responsable de lograr una temprana especificación cardiaca.