Papel de la cooperación FGF/BMP en las vías de señalización que regulan el proceso de cardiogénesis

Abstract

Recientemente ha cobrado una gran relevancia el interés por conocer y entender los reguladores moleculares responsables del desarrollo del corazón. En la presente Tesis Doctoral analizamos los determinantes moleculares de la especificación cardiaca de las células programadas para formar el corazón. Nosotros analizamos las células precardiacas desde su localización inicial a nivel de la línea primitiva, y posterior migración hacia mesodermo precardiaco y constitución del tubo cardiaco, sus características moleculares, el patrón de expresión de genes específicos y los factores implicados en la inducción o represión de la especificación cardiaca. Para ello, hemos planteado una serie de estudios experimentales, utilizando como modelo el embrión de pollo. Actuando sobre embriones en cultivo, hemos llevado a cabo experimentos de ganancia de función, utilizando diferentes factores, entre ellos Fgf8, Bmp2 y miR-130, mediante técnicas de electroporación y aplicación de esferas acrílicas sobre las células precardíacas, desde fases muy iniciales del desarrollo. Simultáneamente, hemos llevado a cabo experimentos de pérdida de función mediante Fgf8 siRNA; SU5402, bloqueante de la señal FGF; nogina, inhibidor de Bmp; y anti-miR-130. Nuestros resultados muestran que la sobre-expresión de Fgf8 conduce a una disminución de la expresión de los factores de transcripción Nkx-2.5, el primer marcador de diferenciación cardíaca, y Gata4. Además, disminuye la expresión de Bmp2. Los experimentos de sobreexpresión de Bmp2 conducen a un incremento de expresión de Nkx-2.5 y Gata4, así como a una disminución de la expresión de Fgf8 y de la señal Erk1/2 a nivel de los tubos endocárdicos. Estos datos son concordantes con nuestros resultados obtenidos mediante los experimentos de pérdida de función, que establecen efectos opuestos a los referidos. Adicionalmente, hemos analizado el papel de miR-130, un microRNA que se une a secuencias específicas en el 3'UTR del gen diana Erk1/2 (Mapk1). Observamos que la expresión de miR-130 se localiza en el mesodermo precardiaco y su correspondiente endodermo adyacente del campo cardiaco primario. Nuestros experimentos de sobreexpresión de miR-130 ponen de manifiesto que suprime la expresión de Fgf8 a nivel de los tubos endocárdicos, e induce la expresión de Nkx-2.5 y Gata4; además, controla la expresión de miR-133, también específico de áreas precardiacas; y lo más relevante, induce un incremento de la expresión de Bmp2, un factor que mantiene una íntima relación con otros aquí analizados, dentro de la vía de las catecolaminas, poniendo de manifiesto un papel activo de estos factores en el proceso de diferenciación cardíaca. 2 En conjunto, nuestros resultados sugieren un proceso de feed-back negativo entre Bmp2 y Fgf8, regulado a través de miR130 y mediado por la señal de Erk1/2, lo que constituye un elemento crucial que participa en el patrón preciso del desarrollo temprano del corazón.

Over the last few years, the challenge to understand those molecular determinants responsible for heart development has taken on special relevance. In the present Doctoral Thesis, we analyze the molecular determinants of cardiac specification of cells programmed to form the heart. With this perspective, we examine the prospective cardiogenic cells, from their initial location, at primitive streak level, and their migration to precardiac mesoderm and primitive cardiac tube formation, their molecular characteristics, specific gene expression patterns, and those inductive and repressive factors involved in cardiac specification. We use chick embryo in culture as a model to design groups of experiments based in gain- and loss-of-function. We perform gain-of-function experiments through electroporation and acrylic beads application on the prospective cardiogenic cells from the initial gastrulation by using Fgf8, Bmp2 and miR-130. Simultaneously, we perform loss-of-function experiments by means of Fgf8 siRNA; SU5402, blocker of FGF signal; noggin, which antagonizes Bmp activity; and anti-miR-130. Our results show that over-expression of Fgf8 lead to a decrease in the transcription factor Nkx- 2.5 expression, the earliest marker of cardiac differentiation, and Gata4. Moreover, Fgf8 over-expression decreases Bmp2. Our experiments based on Bmp2 over-expression resulted in an increased Nkx-2.5 and Gata4 expressions, as well as suppression of Fgf8 expression and reduction of Erk1/2 staining, at endocardial tube level. These data agree with the results we obtained by means of loss-of-function experiments, that show the opposite effects. Additionally, we analyze the role of miR-130, a microRNA that binds to specific sequences in the 3´UTR of target gene Erk1/2 (Mapk1). We observe that miR-130 expresses at precardiac mesoderm and underlying endoderm levels of the primary cardiac field. Our results show that over-expression of miR-130 suppresses Fgf8 expression at both primitive endocardial tube levels, and induces Nkx-2.5 and Gata4 expressions. Furthermore, it regulates miR-133 expression, specifically expressed in precradiac areas. The most relevant data, over-expression of miR-130 increase Bmp2 expression, a molecular factor which maintains a close relationship with other factors here analyzed, such as catecholamines pathways, which reveals an active role of these factors in the process of cardiac differentiation. All those data support the establishment of a negative feed-back between Bmp2 and Fgf8 mediated by miR-130 expression and Erk1/2 signal, constituting a crucial element in the precise patterning and early development of the heart.