CpdB bacteriana y ADPRibasa-Mn humana: estudios de dos hidrolasas activas sobre nucleótidos cíclicos

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CpdB bacteriana y ADPRibasa-Mn humana: estudios de dos hidrolasas activas sobre nucleótidos cíclicos

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Título: CpdB bacteriana y ADPRibasa-Mn humana: estudios de dos hidrolasas activas sobre nucleótidos cíclicos
Autor: López Villamizar, Iralis Mercedes
Resumen: CpdB y ADPRibasa-Mn pertenecen a la superfamilia estructural “Metalofosfoesterasas”. Comparten estructura y actividad fosfodiesterasa sobre determinados nucleótidos cíclicos. CpdB. Durante la clonación y expresión heteróloga de una hidrolasa de c-di-AMP en Escherichia coli, dicha actividad apareció en una proteína del hospedador. C-di-AMP regula bacterias gram positivas. Hay poca información sobre gram negativas. Decidimos purificar e identificar la c-di-AMP fosfodiesterasa de E. coli. Su huella peptídica identificó a CpdB, conocida como fosfodiesterasa de nucleótidos 2´,3´-cíclicos y 3´-nucleotidasa. Por vez primera una “Metalofosfoesterasa” aparece entrelas fosfodiesterasas de dinucleótidos cíclicos. Fue clonada y caracterizada como enzima recombinante por primera vez. Se estudió su especificidad de sustrato e inhibición, y se investigaron las funciones de sus dominios (Ndom y Cdom), mediante su expresión separada y la mutación de dos aminácidos. His117 (Ndom) tiene función catalítica y Tyr544 (Cdom) une y reconoce sustrato o inhibidor. Finalmente se prepararon dos proteínas quiméricas con un dominio de Cpdb y otro de UshA, una 5´-nucleotidasa de E. coli. ADPRibasa-Mn. Hidroliza ADP-ribosa, CDP-alcoholes y ADP-ribosa cíclica (cADPR). Dentro de un estudio más amplio sobre bases moleculares de catálisis y especificidad, aquí se prepararon y caracterizaron dos mutantes de la ADPRibasa-Mn humana. His111 participa en el mecanismo catalítico, igual que en CpdB y otras “Metalofosfoesterasas”. Combinando tres mutaciones, se consiguió una ADPRibasa-Mn activa preferentemente sobre cADPR.CpdB and ADPRibase-Mn belong to the ‘Metallophosphoesterases’ structural superfamily. They share structure and phosphodiesterase activity on certain cyclic nucleotides. CpdB. During the cloning and heterologous expression of a c-di-AMP hydrolase in Escherichia coli, such activity appeared associated with a protein of the host. C-di-AMP regulates gram-positive bacteria. There is little information about gram negatives. We decided to purify and identify the c-di-AMP phosphodiesterase of E. coli. Its peptide fingerprint pointed to CpdB, known as 2´,3´-cyclic nucleotide phosphodiesterase and 3´-nucleotidase. Never before a ‘Metallophosphoesterase’ appeared among cyclic dinucleotide phosphodiesterases. It was cloned and characterized as recombinant enzyme for the first time. Its substrate and inhibitor specificity was studied, and the functions of its domains (Ndom and Cdom) were investigated, through their separate expression and mutagenesis of two amino acids. His117 (Ndom) has catalytic function, and Tyr544 (Cdom) binds and recognizes substrate or inhibitor. Finally, two chimeric proteins were constructed bearing a CpdB domain bound to another from UshA, a 5´-nucleotidase from E. coli. ADPRibase-Mn. It hydrolyzes ADP-ribose, CDP-alcohols and cyclic ADP-ribose (cADPR). As part of a wider study on the molecular bases of catalysis and specificity, two mutants of Human ADPRibase-Mn were constructed and studied. His111 participates in catalysis, like in CpdB and other ‘Metallophosphoesterases’. By combination of three mutations, an ADPRibase-Mn preferentially active on cADPR was obtained.
URI: http://hdl.handle.net/10662/3384
Fecha: 2015-10-08


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