Replicación inducida por estrés térmico en bacterias y plásmidos

Abstract

La duplicación del genoma de una célula antes de su división es un proceso esencial en el ciclo celular. “Escherichia coli” posee un único cromosoma circular que es replicado de forma precisa una vez por ciclo celular. El grupo de investigación donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral ha descrito y caracterizado la replicación inducida por estrés térmico, HIR (Heat Induced Replication), en el cromosoma de E. coli que escapa al control del ciclo celular.

Una vez que HIR ha sido definida en E. coli, en esta Tesis se amplia el estudio de HIR a otros replicones bacterianos. Se ha estudiado HIR en los genomas de otras especies bacterianas modelo (“Salmonella tyhpimurium”, “Bacillus subtilis” y “Vibrio cholerae”) y en varios plásmidos de E. coli con diferente control de la replicación (minicromosomas, F, P1ΔincA, pSC101, R1, p15A y pBR322). El propósito global de este trabajo es el de conocer la generalidad del mecanismo de HIR en el mundo bacteriano y determinar sus requerimientos en los diferentes replicones. Otro aspecto de interés son los efectos de las replicaciones inducidas fuera del control cíclico sobre otros procesos del ciclo celular, tanto en E. coli como en otras especies bacterianas.

Los resultados obtenidos permiten concluir que la replicación termoinducida no es exclusiva de “E. coli” y podemos considerar a HIR como un mecanismo de estrés generalizado en el mundo bacteriano. La medida de GFPmut2 (fluorescencia o dosis génica) es una metodología eficaz para el estudio de HIR en plásmidos; proponemos la espectrofluorimetría y la qPCR como métodos más sencillos, rápidos y precisos que la citometría de flujo y el Southern blot para la cuantificación del número de copias de plásmido.

Genome duplication before cell division is an essential process in the cell cycle. “Escherichia coli” has a single circular chromosome that is precisely replicated once per cell cycle. The research group where this PhD Thesis has been developed has described and characterized the Heat Induced Replication, HIR, for the E. coli chromosome, with different requirements from those of the cyclic replication.

Once HIR has been well defined in “E. coli” chromosome, in this PhD Thesis its study is broadened to other model bacterial species (“Salmonella tyhpimurium”, “Bacillus subtilis” and “Vibrio cholera”) and to “E. coli” plasmids with different replication control (minichromosomes, F, P1ΔincA, pSC101, R1, p15A and pBR322). The global aim of this work is to know the spreading of HIR mechanism in the bacterial world and determining its requirements in the different replicons. Another interesting point is the effect of extra-replications on other cell cycle parameters, both in E. coli and in other species.

With the obtained results we conclude that heat-induced replication is not exclusive of “E. coli” chromosome and HIR can be considered as a stress mechanism widespread in the prokaryotic world. GFPmut2 measurement (fluorescence or gene dose) is an effective method for the study of HIR in plasmids; we propose spectrofluorometry and qPCR as simpler, quicker and more accurate methods than flow cytometry and Southern blot for plasmid copy number quantification.