Desarrollo de métodos de RT-PCR en tiempo real para la cuantificación de mohos toxigénicos viables en alimentos

Abstract

Algunas especies de mohos pueden crecer y producir micotoxinas en alimentos como cereales y derivados cárnicos curado-madurados. Las más importantes debido a su toxicidad e incidencia son las aflatoxinas (AFs) y ocratoxina A (OTA). Por ello, sería necesario el desarrollo de herramientas que ayuden a evitar o minimizar la presencia de estas micotoxinas en alimentos. En este sentido, sería útil disponer de métodos rápidos y eficaces como la RT-qPCR que permitan estudiar cambios en la expresión de genes implicados en la biosíntesis de OTA y AFs anterior a la producción de las mismas que puedan ser incorporados a los programas de monitorización y vigilancia de sistemas APPCC. El objetivo de esta Tesis Doctoral fue desarrollar métodos de RTqPCR para cuantificar mohos viables productores de AFs y OTA en alimentos. Para ello, se optimizó en primer lugar un protocolo de extracción de ARN fúngico directamente de alimentos que combinaba la ruptura del micelio con el mortero y la utilización del kit comercial RNeasy. A continuación, se diseñaron y optimizaron métodos de RT-qPCR basados en los genes aflP, aflR, aflS, otapks y otanps implicados en la biosíntesis de AFs y OTA. Por último, se validaron los métodos en matrices alimentarias donde habitualmente crecen estos mohos detectándose la expresión de estos genes antes de que las micotoxinas sean producidas. Por tanto, los métodos de RT-qPCR optimizados en esta Tesis Doctoral son herramientas útiles y eficientes que pueden ser utilizadas para prevenir la presencia de micotoxinas en alimentos y proteger así la salud del consumidor.

Some mould species may grow and produce mycotoxins in foods including cereals and ripened meat products. Among them aflatoxins (AFs) and ochratoxin A (OTA) are the most important ones due to their toxicity and incidence. For this, it would be necessary to develop tools able to avoid or minimise mycotoxin accumulation in foods. In this sense, it would be used to have rapid and efficient methods such as RT-qPCR which are able to analyse changes in expression of genes involved in AFs and OTA biosynthesis before such mycotoxins are produced. These methods could be used in APPCC systems in the food industry. The main objective of this Doctoral Thesis was to develop RT-qPCR methods for quantification of viable moulds producers of AFs and OTA in foods. For this, a mould RNA extraction method directly from foods was optimised. This protocol consisted of grinding mycelium with the aid of a mortar and pestle and use of the commercial extraction kit RNeasy. Next, methods of RT-qPCR were designed and optimised on the basis of the aflP, aflR, aflS, otapks and otanps genes associated with AFs and OTA synthesis. Finally, the developed RT-qPCR methods were validated in food matrices where moulds normally grow. Such methods were able to detect expression of genes prior to mycotoxin production. Therefore, the methods of RT-qPCR optimized and developed in this Doctoral Thesis are useful and efficient tools which can be used to prevent mycotoxin accumulation in foods and, in this way, protect the consumer health.