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Title: Molecular bases of catalysis and ADP-ribose preference of human Mn2+-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase and conversion by mutagenesis to a preferential cyclic ADP-ribose phosphohydrolase
Authors: Cabezas Martín, Alicia
Ribeiro, João Nuno Meireles da Silva Gonçalves
Rodrigues, Joaquim Rui de Castro
López Villamizar, Iralis Mercedes
Fernández González, Ascensión
Canales García, José Francisco
Pinto Corraliza, Rosa María
Costas Vázquez, María Jesús
Cameselle Viña, José Carlos
Instituto Politécnico de Leiria. Portugal
Universidad de Extremadura. Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética
Keywords: Fosfatasas métalo-dependientes
ADPRibase-Mn-like
ADP-ribosa/CDP-alcohol diphosphatases
ADP-ribosa phosphohydrolases
CDP-alcoholes
Metallo-dependent phosphatases
CDP-alcohols
Issue Date: 2015
Publisher: PLOS/One
Abstract: Entre las fosfatasas métalo-dependientes, ADP-ribosa/CDP-alcohol diphosphatases forman una familia de proteínas (ADPRibase-Mn-like) principalmente restringida, en eucariotas, vertebrados y plantas, con expresión preferencial, al menos en roedores, en células inmunológicas. La rata y el pez cebra, el único Ribase-Mn ADP bioquímicamente estudiados, son ADP-ribosa phosphohydrolases y algo menos eficiente, de CDP-alcoholes y 2',3'-cAMP. Además, la rata, pero no el pez cebra, muestra una única enzima con actividad ADP-ribosa phosphohydrolytic cíclica. La base molecular de tal especificidad es desconocida. Las ADPRibase-Mn de humanos mostraron actividades similares, incluyendo ADP-ribosa phosphohydrolase cíclica, lo que parece común a los mamíferos Ribase-Mn ADP. Acoplamiento del sustrato en un modelo de homología de ADPRibase-Mn de humanos sugiere posibles interacciones de ADP-ribosa con siete residuos ubicado, con una sola excepción (Cys253), ya sea dentro de la metalo-fosfatasas dependientes de la firma (Gln27, Asn110, Su111), o en regiones estructurales exclusivos de la familia ADPRibase-Mn: s2s3 (PHE37 y Arg43) y h7h8 (Phe210), alrededor de la entrada del sitio activo. Se construyeron mutantes y parámetros cinéticos para ADP-ribosa, CDP-colina, 2',3'-cAMP y cíclica de ADP-ribosa fueron determinadas. Phe37 fue necesaria para ADP-ribosa preferencia sin efecto catalítico, según lo indicado por el aumento de la ADP-ribosa Km y kcat invariable de F37A-ADPRibase-Mn Km, mientras que los valores para los otros sustratos apenas se vieron afectadas. Arg43 era esencial para la catálisis como indicado por la drástica pérdida de eficacia demostrada por R43A-ADPRibase-Mn. Inesperadamente, Cys253 obstaculizaba para cADPR phosphohydrolase, según lo indicado por las diez veces la ganancia de eficiencia de C253A-ADPRibase-Mn con ADP-ribosa cíclica. Esto permitió el diseño de un mutante triple (F37A L196F C253A) para que ADP-ribosa cíclica era el mejor sustrato, con una eficiencia catalítica de 3,5'104 M-1s-1 versus 4'103 M-1s-1 del tipo salvaje.
Among metallo-dependent phosphatases, ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatases form a protein family (ADPRibase-Mn-like) mainly restricted, in eukaryotes, to vertebrates and plants, with preferential expression, at least in rodents, in immune cells. Rat and zebrafish ADPRibase-Mn, the only biochemically studied, are phosphohydrolases of ADP-ribose and, somewhat less efficiently, of CDP-alcohols and 2´,3´-cAMP. Furthermore, the rat but not the zebrafish enzyme displays a unique phosphohydrolytic activity on cyclic ADP-ribose. The molecular basis of such specificity is unknown. Human ADPRibase-Mn showed similar activities, including cyclic ADP-ribose phosphohydrolase, which seems thus common to mammalian ADPRibase-Mn. Substrate docking on a homology model of human ADPRibase-Mn suggested possible interactions of ADP-ribose with seven residues located, with one exception (Cys253), either within the metallo-dependent phosphatases signature (Gln27, Asn110, His111), or in unique structural regions of the ADPRibase-Mn family: s2s3 (Phe37 and Arg43) and h7h8 (Phe210), around the active site entrance. Mutants were constructed, and kinetic parameters for ADP-ribose, CDP-choline, 2´,3´-cAMP and cyclic ADP-ribose were determined. Phe37 was needed for ADP-ribose preference without catalytic effect, as indicated by the increased ADP-ribose Km and unchanged kcat of F37A-ADPRibase-Mn, while the Km values for the other substrates were little affected. Arg43 was essential for catalysis as indicated by the drastic efficiency loss shown by R43A-ADPRibase-Mn. Unexpectedly, Cys253 was hindering for cADPR phosphohydrolase, as indicated by the specific tenfold gain of efficiency of C253A-ADPRibase-Mn with cyclic ADP-ribose. This allowed the design of a triple mutant (F37A+L196F+C253A) for which cyclic ADP-ribose was the best substrate, with a catalytic efficiency of 3.5´104 M-1s-1 versus 4´103 M-1s-1 of the wild type.
URI: http://hdl.handle.net/10662/5499
ISSN: 1932-6203
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