A Cyanide-Induced 3-Cyanoalanine Nitrilase in the Cyanide-Assimilating Bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes Strain CECT 5344

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A Cyanide-Induced 3-Cyanoalanine Nitrilase in the Cyanide-Assimilating Bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes Strain CECT 5344

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Title: A Cyanide-Induced 3-Cyanoalanine Nitrilase in the Cyanide-Assimilating Bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes Strain CECT 5344
Author: Acera Hernández, Felipe; Carmona Gallardo, María Isabel; Castillo Rodríguez, Francisco; Quesada Molina, Alberto; Blasco Pla, Rafael
Abstract: Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria capaz de asimilar el cianuro como única fuente de nitrógeno. Bajo esta condición de crecimiento, se indujo una actividad enzimática 3-cianoalanina nitrilasa. Esta actividad fue codificada por nit4, uno de los cuatro genes de nitrilasa detectados en el genoma de esta bacteria, y su expresión en Escherichia coli permitió a la cepa recombinante asimilar completamente la 3-cianoalanina. P. pseudoalcaligenes CECT 5344 mostró un nivel de crecimiento débil con 3-cianoalanina como fuente de N, a menos que también se agregara KCN. Además, un mutante knock-out de nit4 de P. pseudoalcaligenes CECT 5344 se deterioró gravemente en su capacidad para crecer con 3-cianoalanina y cianuro como fuentes de nitrógeno. La enzima nativa expresada en E. coli se purificó hasta homogeneidad electroforética y se caracterizó bioquímicamente. Nit4 parece ser específico para la 3-cianoalanina, y la cantidad de amonio derivada de la actividad enzimática se duplicó en presencia de actividad asparaginasa agregada exógenamente, lo que demostró que la enzima Nit4 tenía actividades tanto 3-cianoalanina nitrilasa como hidratasa. El gen nit4 está ubicado aguas abajo de la unidad transcripcional de resistencia al cianuro que contiene los genes cio1, cuyos niveles de expresión están bajo el control positivo del cianuro. Los experimentos de PCR en tiempo real revelaron que la expresión de nit4 también estaba regulada positivamente por el cianuro tanto en medios mínimos como en medios LB. Estos resultados sugieren que este grupo de genes, incluidos cio1 y nit4, podrían participar tanto en la resistencia al cianuro como en su asimilación por parte de P. pseudoalcaligenes CECT 5344.Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 is a bacterium able to assimilate cyanide as a sole nitrogen source. Under this growth condition, a 3-cyanoalanine nitrilase enzymatic activity was induced. This activity was encoded by nit4, one of the four nitrilase genes detected in the genome of this bacterium, and its expression in Escherichia coli enabled the recombinant strain to fully assimilate 3-cyanoalanine. P. pseudoalcaligenes CECT 5344 showed a weak growth level with 3-cyanoalanine as the N source, unless KCN was also added. Moreover, a nit4 knockout mutant of P. pseudoalcaligenes CECT 5344 became severely impaired in its ability to grow with 3-cyanoalanine and cyanide as nitrogen sources. The native enzyme expressed in E. coli was purified up to electrophoretic homogeneity and biochemically characterized. Nit4 seems to be specific for 3-cyanoalanine, and the amount of ammonium derived from the enzymatic activity doubled in the presence of exogenously added asparaginase activity, which demonstrated that the Nit4 enzyme had both 3-cyanoalanine nitrilase and hydratase activities. The nit4 gene is located downstream of the cyanide resistance transcriptional unit containing cio1 genes, whose expression levels are under the positive control of cyanide. Real-time PCR experiments revealed that nit4 expression was also positively regulated by cyanide in both minimal and LB media. These results suggest that this gene cluster including cio1 and nit4 could be involved both in cyanide resistance and in its assimilation by P. pseudoalcaligenes CECT 5344.
URI: http://hdl.handle.net/10662/8052
Date: 2017


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