Store-operated calcium entry is dispensable for the activation of ERK1/2 pathway in prostate cancer cells

Abstract

STIM1, el sensor de Ca2 + del retículo endoplásmico que modula la actividad de los canales de Ca2 + de la membrana plasmática, se fosforila en los sitios objetivo de ERK1 / 2 durante el agotamiento del almacenamiento de Ca2 + desencadenado por thapsigargin o factor de crecimiento epidérmico (EGF). Esta fosforilación dependiente de ERK1 / 2 regula la localización y disociación de STIM1 de los microtúbulos, y se sabe que mejora la unión a ORAI1, un canal de entrada de Ca2 + (SOCE) operado en el almacén, lo que lleva a la activación de esta vía de afluencia de Ca2 +. Sin embargo, quedaron algunas pruebas de un papel para SOCE en la activación de ERK1 / 2, y aquí evaluamos la contribución de SOCE a la activación de ERK1 / 2 generando una línea celular deficiente en STIM1 mediante la edición del genoma CRISPR / Cas9 del locus STIM1 En células de cáncer de próstata PC3. La modificación genómica consistió en una inserción de pares de 16 bases en el exón 5 de ambos alelos, anulando así la síntesis de STIM1. Las células STIM1-KO mostraron una disminución sorprendente en el flujo de Ca2 + en respuesta a thapsigargin o EGF, un resultado que demuestra que SOCE media la entrada de Ca2 + en las células PC3 durante la estimulación con EGF. Además, se encontraron niveles idénticos de ERK1 / 2 total en células STIM1-KO y en la línea celular parental, y la activación de ERK1 / 2 se activó completamente en células KO, tanto en presencia como en ausencia de Ca2 + extracelular, un resultado que apoya que STIM1 y SOCE no son necesarios para la activación de ERK1 / 2. Esta activación fue sensible a la inhibición de la Src quinasa, pero no a la inhibición de CAMKII ni a la PKC, un resultado que establece a STIM1 y SOCE como objetivos descendentes del eje Src-Raf-MEK-ERK, en lugar de reguladores ascendentes.

STIM1, the endoplasmic reticulum Ca2+ sensor that modulates the activity of plasma membrane Ca2+ channels, becomes phosphorylated at ERK1/2 target sites during Ca2+ store depletion triggered by thapsigargin or epidermal growth factor (EGF). This ERK1/2-dependent phosphorylation regulates STIM1 localization and dissociation from microtubules, and it is known that enhances the binding to ORAI1, a store-operated Ca2+ entry (SOCE) channel, leading to the activation of this Ca2+ influx pathway. However, there remained some evidence of a role for SOCE in the activation of ERK1/2, and here we assessed the contribution of SOCE to ERK1/2 activation by generating a STIM1-deficient cell line by CRISPR/Cas9 genome editing of the STIM1 locus in prostate cancer PC3 cells. The genomic modification consisted of a 16 base -pair insertion in exon 5 of both alleles, therefore abrogating STIM1 synthesis. STIM1-KO cells did show a striking decrease in Ca2+ influx in response to thapsigargin or EGF, a result that demonstrates that SOCE mediates Ca2+ entry in PC3 cells during stimulation with EGF. Moreover, identical levels of total ERK1/2 were found in STIM1-KO cells and the parental cell line, and ERK1/2 activation was fully activated in KO cells, both in the presence and in the absence of extracellular Ca2+, a result that supports that STIM1 and SOCE are not required for ERK1/2 activation. This activation was sensitive to Src kinase inhibition, but not to CAMKII nor PKC inhibition, a result that sets STIM1 and SOCE as downstream targets of the axis Src-Raf-MEK-ERK, rather than upstream regulators.