Desarrollo de métodos cromatográficos de alta resolución para el estudio y cuantificación de folatos, pteridinas y biomarcadores del riesgo a la exposición de contaminantes ambientales, en fluidos biológicos y alimentos

Abstract

La presente Tesis Doctoral aborda el desarrollo de nuevos métodos cromatográficos para la determinación de compuestos de interés en el campo bioanalítico y alimentario, considerados como biomarcadores de la alteración de rutas metabólicas o del riesgo a la exposición de contaminantes ambientales. Los compuestos en estudio son concretamente pteridinas, folatos y los metabolitos del fenantreno. En la primera parte de esta investigación se desarrollan nuevos métodos cromatográficos empleando detección por espectrometría de masas y espectrofluorimétria para el análisis de pteridinas. Debido a la importancia de estos biomarcadores de alteraciones de rutas metabólicas se han optimizado métodos para su determinación en muestras de orina y suero humanos. Por otra parte, se ha optimizado un método de análisis en muestras vegetales, debido a su interés como precursores de folatos. La segunda parte se ha focalizado en el estudio del comportamiento fotoquímico de los folatos, con objeto de posibilitar el uso de técnicas fluorimétricas sensibles como detección. Se han identificado los fotoproductos obtenidos y optimizado un método por HPLC con fotoderivatización y detección fluorimétrica en línea para el ácido fólico y sus metabolitos. Finalmente, la tercera parte se ha centrado en la aplicación de algoritmos quimiométricos a las señales dinámicas de segundo orden obtenidas en la separación cromatográfica de los metabolitos del fenantreno. Estos metabolitos son isómeros que se consideran como biomarcadores del riesgo a la exposición de este hidrocarburo aromático policíclico. El método propuesto permite la determinación simultánea de los cinco metabolitos en leche materna y en leche humana.

This Doctoral Thesis presents the development of new chromatographic methods for the determination of compounds with special interest in the bioanalytic and food field. These compounds are considered as biomarkers of the alteration of metabolic pathways or the risk to exposure of environmental pollutants. The compounds under study are specifically pteridines, folates and the phenanthrene metabolites. In the first part of this Report, new chromatographic methods using mass spectrometry and spectrofluorometric detection are developed for the analysis of pteridines. Due to the importance of these biomarkers of alterations in metabolic pathway, methods for their determination in human urine and serum samples have been optimized. On the other hand, a method for their analysis in plant samples has been optimized, due to its interest as folate precursors. The second part is focused on the study of the photochemical behavior of folates, in order to enable the use of fluorimetric techniques such as detection. The photoproducts obtained have been identified and a HPLC method with online photoderivatization and fluorimetric detection has been optimized for the determination of folic acid and its metabolites. Finally, the third part is focused on the application of chemometric algorithms to the second order dynamic signals obtained in the chromatographic separation of the phenanthrene metabolites. These metabolites are isomers considered as biomarkers of the risk to exposure of this polycyclic aromatic hydrocarbon. The proposed method allows the simultaneous determination of the five metabolites in human and cow milk.