Genetic variation of the β-tubulin of two "Babesia caballi" strains

Abstract

ANTECEDENTES: La piroplasmosis equina es causada por dos parásitos hemoprotozoarios: Babesia caballi y Theileria equi. El impacto económico negativo en el comercio internacional se ha asociado a sitios endémicos. Esta es la razón por la cual la detección de portadores requiere métodos de diagnóstico confiables. Se pueden usar varias modalidades de diagnóstico solas o en combinación, incluida la PCR. Sin embargo, la variación genética de los genes de uso común todavía es de debate. El objetivo de esta investigación fue secuenciar el gen de β-tubulina de una cepa de B. caballi de España y compararlo con las secuencias de β-tubulina conocidas. MÉTODOS: se aisló el ADN de una cepa crioconservada de España y caballos portadores agudos y crónicos. En primer lugar, los pares de cebadores degenerados se diseñaron según las secuencias de GenBank de diferentes especies de Babesia y Theileria para la secuenciación. Los cebadores fueron rediseñados para amplificar ambos parásitos, simultáneamente. Finalmente, se diseñó un par de cebadores específicos de especie para B. caballi y se realizó un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) para conocer la diferencia de las cepas conocidas de B. caballi. RESULTADOS: Brindamos nuevos conocimientos sobre el gen de la β-tubulina y una buena cobertura molecular de este gen, contribuyendo con una serie de cebadores útiles para amplificar T. equi y B. caballi. Además, los ensayos de PCR-RFLP basados en el exón II de este gen confirmaron la cepa causante de B. caballi en caballos españoles. CONCLUSIÓN: Se informaron pares de cebadores útiles para el diagnóstico y una nueva secuencia del gen de la β-tubulina de B. caballi, que facilitará el desarrollo de ensayos futuros y la detección de caballos infectados, previniendo así la propagación de esta enfermedad en todo el mundo.

BACKGROUND: Equine piroplasmosis is caused by two haemoprotozoan parasites: Babesia caballi and Theileria equi. Negative economic impact on international trade has been associated to endemic sites. This is the reason why carrier detection requires reliable diagnostic methods. Various diagnostic modalities can be used alone or in combination including PCR. However, genetic variation of commonly used genes is still of debate. The aim of this research was to sequence the β-tubulin gene of a B. caballi strain from Spain and to compare it with known β-tubulin sequences. METHODS: DNA was isolated from a cryopreserved strain from Spain and acute and chronic carrier horses. Firstly, degenerated primer pairs were designed based on GenBank sequences of different Babesia and Theileria species for sequencing. The primers were redesigned to amplify both parasites, simultaneously. Finally, a species-specific primer pair for B. caballi was designed and a Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR (PCR-RFLP) assay performed to know the difference of known B. caballi strains. RESULTS: We provided new insights of the β-tubulin gene and a good molecular coverage of this gene, contributing with a number of useful primers to amplify T. equi and B. caballi. Moreover, PCR-RFLP assays based on the exon II of this gene confirmed the causative B. caballi strain in Spanish horses.