Selected Metabolites Found in Equine Oviductal Fluid do not Modify the Parameters Associated to Capacitation of the Frozen-thawed Equine Spermatozoa "In Vitro"

Abstract

In the horse, a repeatable protocol for in vitro fertilization has not been developed, possibly due to incomplete sperm capacitation. We have previously identified the metabolites present in equine oviductal fluid (OF). We aimed to test the effects of different metabolites found in equine oviductal fluid on quality parameters of frozen-thawed spermatozoa. Different concentrations of myoinositol (5–25 mM), lactate (6–60 mM), glycine (0.1–5 mM), β-alanine (1–6 mM), and histamine (0.05–0.4 mM) were added independently to modified Whitten's medium (pH = 7.25). Thawed equine spermatozoa (three stallions, one ejaculate per stallion, n = 3) were incubated for 2 hours at 37˚C in presence of the selected metabolites. After sperm incubation, total motility (TM), and progressive motility (PM) were evaluated by computer-assisted sperm analysis. Viability (SYBR-14+/PI−), mitochondrial membrane potential (ΔΨm) (JC-1), acrosome reaction (PNA+/PI−) and reactive oxygen species (ROS) production (CellRox+/PI−), were evaluated by flow cytometry. Protein tyrosine phosphorylation (PY) was evaluated by indirect immunofluorescence. Our results show that the addition of the metabolites at the dosages tested does not exert any effect on the sperm parameters analyzed. More research is needed to ascertain if metabolite addition at the dosages found in the equine OF exerts any remarkable effect on in vitro equine sperm capacitation.

En el caballo, no se ha desarrollado un protocolo repetible para la fertilización in vitro, posiblemente debido a una capacitación incompleta de los espermatozoides. Hemos identificado previamente los metabolitos presentes en el líquido oviductal equino (OF). Nuestro objetivo fue probar los efectos de diferentes metabolitos encontrados en el líquido oviductal equino sobre los parámetros de calidad de los espermatozoides congelados y descongelados. Se agregaron independientemente diferentes concentraciones de mioinositol (5 a 25 mM), lactato (6 a 60 mM), glicina (0,1 a 5 mM), β-alanina (1 a 6 mM) e histamina (0,05 a 0,4 mM). Medio de Whitten (pH = 7,25). Los espermatozoides equinos descongelados (tres sementales, un eyaculado por semental, n = 3) se incubaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de los metabolitos seleccionados. Después de la incubación de los espermatozoides, se evaluaron la motilidad total (TM) y la motilidad progresiva (PM) mediante análisis de espermatozoides asistido por computadora. La viabilidad (SYBR-14+/PI−), el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) (JC-1), la reacción del acrosoma (PNA+/PI−) y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (CellRox+/PI−), se evaluaron por flujo citometría La fosforilación de proteína tirosina (PY) se evaluó por inmunofluorescencia indirecta. Nuestros resultados muestran que la adición de los metabolitos a las dosis ensayadas no ejerce ningún efecto sobre los parámetros espermáticos analizados. Se necesita más investigación para determinar si la adición de metabolitos en las dosis encontradas en el OF equino ejerce algún efecto notable sobre la capacitación in vitro del esperma equino.