A simple flow cytometry protocol to determine simultaneously live, dead and apoptotic stallion spermatozoa in fresh and frozen thawed samples

Abstract

Spermatozoa undergo apoptotic changes during the cryopreservation process. These changes, recently termed spermptosis, resemble the cryopreservation induced delayed onset of cell death observed after thawing of somatic cells. Due to its importance in cryobiology, methods to easily identify spermptotic cells are warranted. In this study, a well-validated method for identification of spermatozoa with caspase 3 activity was compared with use of the combination of Hoechst 33342 (H-42) and ethidium homodimer (Eth-1). Live, dead and apoptotic spermatozoa assessed with each method were compared using descriptive statistics and method agreement analysis. No differences were observed in the percentages of spermatozoa in each of the categories investigated with each method. Moreover the method agreement analysis indicated there were consistent findings using both methods The combination H-42/Eth-1 can be successfully used to determine apoptosis in addition to dead and live spermatozoa. Moreover the intensity of H-42 fluorescence (bright and dim populations) allows for distinguishing of live and dead sperm cells.

Los espermatozoides sufren cambios apoptóticos durante el proceso de crioconservación. Estos cambios, denominados recientemente espermptosis, se asemejan a la aparición retardada de la muerte celular inducida por la criopreservación que se observa tras la descongelación de las células somáticas. Debido a su importancia en la criobiología, es necesario disponer de métodos para identificar fácilmente las células espermptóticas. En este estudio, se comparó un método bien validado para la identificación de espermatozoides con actividad de caspasa 3 con el uso de la combinación de Hoechst 33342 (H-42) y homodímero de etidio (Eth-1). Los espermatozoides vivos, muertos y apoptóticos evaluados con cada método se compararon mediante estadística descriptiva y análisis de concordancia de métodos. No se observaron diferencias en los porcentajes de espermatozoides en cada una de las categorías investigadas con cada método. La combinación H-42/Eth-1 puede utilizarse con éxito para determinar la apoptosis además de los espermatozoides vivos y muertos. Además, la intensidad de la fluorescencia del H-42 (poblaciones brillantes y tenues) permite distinguir entre espermatozoides vivos y muertos.