Protective effect of melatonin against human leukocyte apoptosis induced by intracellular calcium overload: relation with its antioxidant actions

Abstract

Apoptosis or programmed cell death plays a critical role in both inflammatory and immune responses. Recent evidence demonstrates that control of leukocyte apoptosis is one of the most striking immune system-related roles of melatonin. For this reason, this study evaluated the protective effects of melatonin on human leukocyte apoptosis induced by sustained cytosolic calcium increases. Such protective effects are likely mediated by melatonin's free-radical scavenging actions. Treatments with the specific inhibitor of cytosolic calcium re-uptake, thapsigargin (TG), and/or the calcium-mobilizing agonist, N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP), induced intracellular reactive oxygen species (ROS) production, caspase activation as well as DNA fragmentation in human leukocytes. Also, TG- and/or FMLP-induced apoptosis was dependent on both cytosolic calcium increases and calcium uptake into mitochondria, because when cells were preincubated with the cytosolic calcium chelator, dimethyl BAPTA, and the inhibitor of mitochondrial calcium uptake, Ru360, TG- and FMLP-induced apoptosis was largely inhibited. Importantly, melatonin treatment substantially prevented intracellular ROS production, reversed caspase activation, and forestalled DNA fragmentation induced by TG and FMLP. Similar results were obtained by preincubating the cells with another wellknown antioxidant, i.e., N-acetyl-L-cysteine. To sum up, depletion of intracellular calcium stores induced by TG and/or FMLP triggers different apoptotic events in human leukocytes that are dependent on calcium signaling. The protective effects resulting from melatonin administration on leukocyte apoptosis likely depend on melatonin's antioxidant action because we proved that this protection is melatonin receptor independent. These findings help to understand how melatonin controls apoptosis in cells of immune/inflammatory relevance.

La apoptosis o muerte celular programada juega un papel crítico en las respuestas inflamatorias e inmunitarias. La evidencia reciente demuestra que el control de la apoptosis leucocitaria es uno de los roles más llamativos relacionados con el sistema inmunitario de la melatonina. Por esta razón, en este estudio se evaluaron los efectos protectores de la melatonina sobre la apoptosis leucocitaria humana inducida por aumentos sostenidos del calcio citosólico. Es probable que estos efectos protectores estén mediados por las acciones de eliminación de radicales libres de la melatonina. Los tratamientos con el inhibidor específico de la recaptación citosólica de calcio, la tasigargina (TG), y/o el agonista movilizador del calcio, N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP), indujeron la producción de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS), la activación de la caspasa y la fragmentación del ADN en los leucocitos humanos. Además, la apoptosis inducida por TG y/o FMLP dependía tanto de los aumentos del calcio citosólico como de la captación de calcio en las mitocondrias, porque cuando las células fueron preincubados con el quelante citosólico de calcio, dimetil BAPTA, y el inhibidor de la captación mitocondrial de calcio, Ru360, la apoptosis inducida por TG y FMLP fue ampliamente inhibida. Es importante destacar que el tratamiento con melatonina evitó sustancialmente la producción intracelular de ERO, revirtió la activación de la caspasa y evitó la fragmentación del DNA inducida por TG y FMLP. Se obtuvieron resultados similares al preincubar las células con otro antioxidante bien conocido, es decir, N-acetil-L-cisteína. En resumen, el agotamiento de los depósitos intracelulares de calcio inducido por TG y/o FMLP desencadena diferentes eventos apoptóticos en leucocitos humanos que dependen de la señalización del calcio. Los efectos protectores derivados de la administración de melatonina sobre la apoptosis leucocitaria dependen probablemente de la acción antioxidante de la melatonina, ya que hemos demostrado que esta protección es independiente del receptor de la melatonina. Estos hallazgos ayudan a entender cómo la melatonina controla la apoptosis en células de relevancia inmune/inflamatoria.