The inhibition of TNF-α-induced leucocyte apoptosis by melatonin involves membrane receptor MT1/MT2 interaction

Abstract

The pro-apoptotic signalling cascades induced by tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) have been intensively studied in multiple cellular systems. So far, it is known that TNF-α can simultaneously activate survival and apoptotic cell death responses. The balance between these signals determines the ultimate response of the cell to TNF-α. Moreover, emerging evidence suggests that melatonin may be involved in the protection of different cell types against apoptosis. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of melatonin on TNF-α-induced apoptosis in human leucocytes. Cells were treated with TNF-α alone or in the presence of cycloheximide (CHX), which promotes caspase-8 activation by eliminating the endogenous caspase-8 inhibitor, c-FLIP. Treatment with TNF-α/CHX led to apoptotic cell death, as ascertained by annexin V/propidium iodide (PI) staining. Likewise, in the presence of CHX, TNF-α stimulation produced cFLIP down-regulation and subsequent caspase-8 activation, thus directly triggering caspase-3 activation and causing Bid truncation and subsequent caspase-9 activation. Conversely, pre-incubation of cells with melatonin inhibited TNF-α-/CHX-evoked leucocyte apoptosis. Similarly, pretreatment of leucocytes with melatonin increased cFLIP protein levels, thereby preventing TNF-α-/CHX-mediated caspase processing. Blockade of melatonin membrane receptor MT1/MT2 or extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway with luzindole or PD98059, respectively, abolished the inhibitory effects of melatonin on leucocyte apoptosis evoked by TNF-α/CHX. In conclusion, the model proposed by these findings is that the MT1/MT2 receptors, which are under the positive control of melatonin, trigger an ERK-dependent signalling cascade that interferes with the anti-apoptotic protein cFLIP modulating the cell life/death balance of human leucocytes.

Las cascadas de señalización pro-apoptótica inducidas por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) han sido estudiadas intensivamente en múltiples sistemas celulares. Hasta ahora, se sabe que el TNF-α puede activar simultáneamente la supervivencia y las respuestas de muerte celular apoptótica. El equilibrio entre estas señales determina la respuesta final de la célula al TNF-α. Además, la evidencia emergente sugiere que la melatonina puede estar involucrada en la protección de diferentes tipos celulares contra la apoptosis. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la melatonina sobre la apoptosis inducida por TNF-α en leucocitos humanos. Las células fueron tratadas con TNF-α solo o en presencia de cicloheximida (CHX), que promueve la activación de la caspasa-8 al eliminar el inhibidor endógeno de la caspasa-8, c-FLIP. El tratamiento con TNF-α/CHX provocó la muerte celular por apoptosis, que se determinó mediante la tinción con anexina V/yoduro de propidio (IP). Asimismo, en presencia de CHX, la estimulación con TNF-α produjo la regulación descendente de cFLIP y la activación posterior de la caspasa-8, lo que desencadenó directamente la activación de la caspasa-3 y causó el truncamiento de Bid y la activación posterior de la caspasa-9. Por el contrario, la preincubación de células con melatonina inhibió la apoptosis leucocitaria provocada por TNF-α-/CHX. Del mismo modo, el tratamiento previo de los leucocitos con melatonina aumentó los niveles de proteína cFLIP, impidiendo así el procesamiento de la caspasa mediada por TNF-α-/CHX. El bloqueo de los receptores MT1/MT2 de la membrana de la melatonina o de la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) con luzindol o PD98059, respectivamente, abolió los efectos inhibitorios de la melatonina sobre la apoptosis leucocitaria provocada por el TNF-α/CHX. En conclusión, el modelo propuesto por estos hallazgos es que los receptores MT1/MT2, que están bajo el control positivo de la melatonina, desencadenan una cascada de señalización dependiente de ERK que interfiere con la proteína antiapoptótica cFLIP modulando el balance vida/muerte celular de los leucocitos humanos.