Inhibition by 4-hydroxynonenal (HNE) of Ca2+ transport by SERCA1a: Low concentrations of HNE open protein-mediated leaks in the membrane

Abstract

Exposure of sarcoplasmic reticulum membranes to 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) resulted in inhibition of the maximal ATPase activity and Ca2+ transport ability of SERCA1a, the Ca2+ pump in these membranes. The concomitant presence of ATP significantly protected SERCA1a ATPase activity from inhibition. ATP binding and phosphoenzyme formation from ATP were reduced after treatment with HNE, whereas Ca2+ binding to the high-affinity sites was altered to a lower extent. HNE reacted with SH groups, some of which were identified by MALDI-TOF mass spectrometry, and competition studies with FITC indicated that HNE also reacted with Lys515 within the nucleotide binding pocket of SERCA1a. A remarkable fact was that both the steady-state ability of SR vesicles to sequester Ca2+ and the ATPase activity of SR membranes in the absence of added ionophore or detergent were sensitive to concentrations of HNE much smaller than those that affected the maximal ATPase activity of SERCA1a. This was due to an increase in the passive permeability of HNE-treated SR vesicles to Ca2+, an increase in permeability that did not arise from alteration of the lipid component of these vesicles. Judging from immunodetection with an anti-HNE antibody, this HNE-dependent increase in permeability probably arose from modification of proteins of about 150–160 kDa, present in very low abundance in longitudinal SR membranes (and in slightly larger abundance in SR terminal cisternae). HNE-induced promotion, via these proteins, of Ca2+ leakage pathways might be involved in the general toxic effects of HNE.

La exposición de las membranas del retículo sarcoplásmico al 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) provocó la inhibición de la actividad ATPasa máxima y de la capacidad de transporte de Ca2+ de SERCA1a, la bomba de Ca2+ de estas membranas. La presencia concomitante de ATP protegió significativamente la actividad ATPasa de SERCA1a de la inhibición. La unión a ATP y la formación de fosfoenzimas a partir de ATP se redujeron tras el tratamiento con HNE, mientras que la unión de Ca2+ a los sitios de alta afinidad se alteró en menor medida. El HNE reaccionó con grupos SH, algunos de los cuales fueron identificados por espectrometría de masas MALDI-TOF, y los estudios de competencia con FITC indicaron que el HNE también reaccionó con Lys515 dentro del bolsillo de unión a nucleótidos de SERCA1a. Un hecho destacable fue que tanto la capacidad en estado estacionario de las vesículas SR para secuestrar Ca2+ como la actividad ATPasa de las membranas SR en ausencia de ionóforo o detergente añadido fueron sensibles a concentraciones de HNE mucho menores que las que afectaron a la actividad ATPasa máxima de SERCA1a. Esto se debió a un aumento de la permeabilidad pasiva de las vesículas del RE tratadas con HNE al Ca2+, un aumento de la permeabilidad que no se debió a una alteración del componente lipídico de estas vesículas. A juzgar por la inmunodetección con un anticuerpo anti-HNE, este aumento de la permeabilidad dependiente del HNE probablemente surgió de la modificación de proteínas de unos 150-160 kDa, presentes en muy baja abundancia en las membranas longitudinales del SR (y en abundancia ligeramente mayor en las cisternas terminales del SR). La promoción inducida por el HNE, a través de estas proteínas, de las vías de fuga de Ca2+ podría estar implicada en los efectos tóxicos generales del HNE.