Desarrollo de nuevos métodos no invasivos aplicados al diagnóstico mediante PCR a tiempo real de la leishmaniosis

Abstract

En la actualidad el diagnóstico de la leishmaniosis está basado en una combinación de varios métodos: detección del parásito por microscopía, tests inmunológicos y técnicas moleculares como la PCR a tiempo real. El uso de esta última proporciona resultados reproducibles y muy sensibles. Las muestras utilizadas habitualmente para este tipo de análisis se obtienen de manera invasiva, causando estrés al animal y rechazo por parte de los propietarios. Por ello es importante el uso de métodos no invasivos como una alternativa para el diagnóstico de la leishmaniosis. En este trabajo se plantearon distintos objetivos enfocados a la evaluación del pelo, cerumen y queratinocitos epidérmicos de una población de perros con Lcan adquirida de forma natural, al estudio del pelo de diversas especies de animales silvestres y al análisis del pelo de ratones infectados experimentalmente con la especie de tropismo cutáneo Leishmania major, todo ello utilizando el método molecular qPCR. Los resultados obtenidos muestran por primera vez la detección y cuantificación del ADN del kinetoplasto (ADNk) de L. infantum en el pelo, cerumen y queratinocitos epidérmicos de perros con Lcan y en el pelo de diversas especies de mamíferos silvestres, junto la cronología de la incorporación del ADNk de L. major al pelo en un modelo ratón durante el curso de una infección experimental. En conclusión, se ha realizado una nueva aportación al diagnóstico molecular de la leishmaniosis mediante el desarrollo de métodos fiables y precisos empleando muestras no invasivas, aplicables en estudios epidemiológicos e infecciones experimentales.

Clinical diagnosis of canine leishmaniosis is based on different methods: parasite detection through microscope, immunological tests and molecular techniques as Real Time PCR. The use of this method provides the ability to perform sensitive and reproducible analysis. The samples commonly used for this kind of analysis are obtained by invasive methods that cause animal distress and owner reluctance. Therefore, it is important to test non-invasive samples as an alternative for the diagnosis of leishmaniosis. Thus, the objectives of the work were, using the molecular method qPCR: to evaluate hair, cerumen and epidermal keratinocytes from a population of dogs with CanL naturally infected, to study hair from different wild animals and to analyze hair from mice experimentally infected with Leishmania major (cutaneous leishmaniosis model). The results obtained in this study show the first detection of L. infantum kinetoplast DNA (kDNA) in hair, cerumen and epidermal keratinocytes of dogs with CanL and in hair from different wild animals. It has been also determined the chronology of the appearance of L. major kDNA in the hair of a mouse model during a follow up period of infection. To conclude, the present work has made a new contribution to the molecular diagnosis of leishmaniosis by developing reliable and accurate methods using non-invasive samples, which can be applied in epidemiological studies and experimental infections.