Methyl–cyclodextrin impairs the phosphorylation of the 2 subunit of L-type calcium channels and cytosolic calcium homeostasis in mature cerebellar granule neurons

Abstract

La activación de los canales de calcio de tipo L (LTCC) impide que las neuronas de gránulos cerebelosos (CGN) entren en la apoptosis inducida por bajo K+. En trabajos anteriores, demostramos que los LTCC están en gran medida asociados con balsas de lípidos ricos en caveolina-1 en la membrana plasmática de las CGN. En este trabajo, mostramos que la proteína cinasa A (PKA) y la proteína cinasa dependiente de calmodulina II (CaMK-II) están asociadas con las balsas de lípidos ricos en caveolina-1 de los CGN maduros, y mostramos además que el tratamiento con el agente atrapador de colesterol y disruptor de balsa de lípidos metil- β -ciclodextrina disminuye el nivel de fosforilación de la subunidad β2 del CCLT y la concentración de calcio en estado estable en los somas neuronales ([Ca2+]i) a valores cercanos a los medidos en condiciones proapoptóticas de 5 mM KCl. Estos efectos se correlacionan con los efectos producidos por un tratamiento corto (15 min) de CGN con inhibidores H-89 y KN-93 de PKA y CaMK-II, respectivamente, en un medio de 25 mM KCl. Además, sólo una incubación de 15 min de CGN con H-89 produce alrededor de un 90% de inhibición de la entrada de calcio que normalmente ocurriría a través de los LTCC para aumentar [Ca2+]i al elevar el K+ extracelular de 5 a 25 mM, es decir, de condiciones proapoptóticas a condiciones de supervivencia. En conclusión, los resultados de este trabajo sugieren que las balsas de lípidos ricos en caveolina-1 desempeñan un papel importante en el control del nivel de fosforilación inducida por la PKA y el CaMK-II de la subunidad β2 del CCLT, evitando así que los CGN entren en apoptosis.

The activation of L-type calcium channels (LTCCs) prevents cerebellar granule neurons (CGNs) from entering low-K+-induced apoptosis. In previous works, we showed that LTCCs are largely associated with caveolin-1-rich lipid rafts in the CGN plasma membrane. In this work, we show that protein kinase A (PKA) and calmodulin-dependent protein kinase II (CaMK-II) are associated with caveolin-1-rich lipid rafts of mature CGNs, and we further show that treatment with the cholesterol-trapping and lipid raft-disrupting agent methyl- β -cyclodextrin decreases the phosphorylation level of the LTCC β2 subunit and the steady-state calcium concentration in neuronal somas ([Ca2+]i) to values close to those measured in 5 mM KCl proapoptotic conditions. These effects correlate with the effects produced by a short (15 min) treatment of CGNs with H-89 and KN-93—inhibitors of PKA and CaMK-II, respectively—in 25 mM KCl medium. Moreover, only a 15 min incubation of CGNs with H-89 produces about a 90% inhibition of the calcium entry that would normally occur through LTCCs to increase [Ca2+]i upon raising the extracellular K+ from 5 to 25 mM, i.e., from proapoptotic to survival conditions. In conclusion, the results of this work suggest that caveolin-1-rich lipid rafts play a major role in the control of the PKA- and CaMK-II-induced phosphorylation level of the LTCC β2 subunit, thus preventing CGNs from entering apoptosis.