Técnica de silenciamiento génico

Abstract

Para realizar silenciamiento génico en placas de 6 pocillos (130184, Biolite) se emplean el reactivo HiPerfect Transfection Reagent (509301704, Qiagen); el reactivo Lipofectamine RNAiMAX Transfection (13778150, Invitrogen) y el reactivo Lipofectamine 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen). En los tres procesos se elabora la misma mezcla con siRNA para el control negativo (scrambled) en paralelo. A las 24 horas de incubación con cualquiera de los reactivos se cambia el medio a la placa y se añade medio normal con antibiótico. Con el primer reactivo, pasadas otras 24 horas se añade el tratamiento de interés y se procede al lisado para realizar la técnica de Western blotting. Con el segundo reactivo, tras las 24 horas y el tratamiento adecuado, se procede a fijar la placa con PFA. Con el tercer reactivo, se dejan pasar 24 horas, se aplica el tratamiento previsto y se pasa a la recogida de células y posterior lisado.

For gene silencing in 6-well plates (130184, Biolite), HiPerfect Transfection Reagent (509301704, Qiagen); Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (13778150, Invitrogen) and Lipofectamine 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen) are used. In all three processes, the same mixture with siRNA for the negative control (scrambled) is prepared in parallel. After 24 hours of incubation with any of the reagents, the medium is changed to the plate and normal medium with antibiotic is added. With the first reagent, after another 24 hours, the treatment of interest is added and the lysate is lysed for Western blotting. With the second reagent, after 24 hours and the appropriate treatment, the plate is fixed with PFA. With the third reagent, 24 hours are allowed to elapse, the expected treatment is applied and the cells are collected and subsequently lysed.