Análisis Seahorse

Abstract

Para medir el metabolismo celular a partir de análisis Seahorse, hay que resuspender las células antes de contarlas y sembrarlas, y determinar la concentración ideal de siembra. Si las células no son adherentes, se puede pre-tratar la placa con polilisina o colágeno. Preparar más volumen de medio + células para utilizar la pipeta multicanal y no utilizar volúmenes demasiado pequeños y así, evitar errores. Después de 2 horas, dejar con 80 μl de medio para evitar mover las células. Éstas no estarán pegadas y se pueden ir a los bordes. Si se hidrata con H2O miliQ hay que cambiarlo, al menos una hora antes de realizar el experimento. Si se hidrata directamente con el tampón de calibrado, no debe estar más de 24 horas. Si las células no estuvieran el día 2, se cambia el agua y se rehidrata con el tampón 1 hora antes del experimento. El volumen del tratamiento es de 100 μl/pocillo. Preparar el medio Seahorse adicionando glutamina 1X, glucosa 10 mM y sodio piruvato 1X. Antes de añadir ningún inhibidor, meter y sacar varias veces el cartucho del líquido de calibrado para eliminar cualquier burbuja que se haya podido generar. Añadir de izquierda a derecha apoyando la punta de la pipeta multicanal en la pared y de forma muy lenta para que resbale poco a poco. Luego, meter las placas en el aparato sin las tapas. Al finalizar el calibrado, el aparato pide la placa de las células y devuelve la placa con el líquido de calibrado. La placa de las células estará no menos de 45 minutos en la estufa. Comenzará con una etapa de equilibrado. Tras 13 minutos, ofrecerá las medidas basales y las inyecciones. Al terminar todo el proceso, cuya duración dependerá del kit utilizado y de las modificaciones hechas, pedirá que se finalice el programa y la máquina devolverá el cartucho y la placa de las células.

To measure cell metabolism from Seahorse assays, resuspend the cells before counting and seeding, and determine the ideal seeding concentration. If the cells are not adherent, the plate can be pre-treated with poly-L-lysine or collagen. Prepare more volume of medium + cells to use the multichannel pipette and do not use too small volumes to avoid errors. After 2 hours, leave with 80 μl of medium to avoid moving the cells. The cells will not be stuck together and may go to the edges. If hydrated with H2O miliQ, change the medium at least one hour before the experiment. If hydrated directly with the calibration buffer, it should not be more than 24 hours. If the cells were not present on day 2, the water is changed and rehydrated with the buffer 1 hour before the experiment. The treatment volume is 100 μl/well. Prepare Seahorse medium by adding 1X glutamine, 10 mM glucose and 1X sodium pyruvate. Before adding any inhibitor, dip the cartridge in and out of the calibration liquid several times to remove any bubbles that may have been generated. Add from left to right with the tip of the multichannel pipette resting on the wall and very slowly so that it slides off little by little. Then place the plates in the apparatus without the lids. At the end of the calibration, the apparatus asks for the cell plate and returns the plate with the calibration liquid. The cell plate shall remain in the oven for at least 45 minutes. It will start with a balancing step. After 13 minutes, it will provide the basal measurements and injections. At the end of the whole process, the duration of which will depend on the kit used and the modifications made, it will ask for the programme to be terminated and the machine will return the cartridge and the cell plate.