Regulación de la actividad y localización subcelular del canal de Ca2+ ORAI1 por el citoesqueleto en el frente de migración

Abstract

La migración celular requiere de la reorganización del citoesqueleto de actina para la formación de protrusiones de membrana y un frente de migración polarizado. Esta reorganización del citoesqueleto se conoce como ruffling (ondulaciones) de membrana y es activada por la polimerización de la actina cortical a través del complejo ARP2/3 y la proteína WAVE mediante un proceso regulado por la actividad RAC1. Dada la importancia del ion Ca2+ en migración, en esta Tesis Doctoral se ha estudiado el papel en el frente de migración de la proteína ORAI1, un canal de membrana que participa en SOCE (entrada de calcio operada por el vaciado de depósitos). Mediante el empleo de la línea celular de osteosarcoma humano U2OS, modificada por edición genómica con CRISPR/Cas9, hemos observado que las células deficientes en ORAI1 presentan una reducción significativa del ruffling de membrana y una ralentización de la migración celular, así como una disminución del potencial invasivo de las células U2OS en el larvas de pez cebra, empleadas como modelo animal. Además, nuestros resultados muestran que ORAI1 se transloca a la membrana plasmática e interacciona con CTTN, ARP2/3 y CYFIP1, agentes promotores de la nucleación de actina para la generación de lamelipodios, mediante un mecanismo dependiente de la actividad RAC1. Por último, proponemos un mecanismo de regulación de SOCE mediante fosforilación tras observar que la inhibición de la fosforilación de la Thr295 y Ser298 de ORAI1 induce un aumento en la entrada de Ca2+ en la célula y un enriquecimiento de ORAI1 en vesículas intracelulares.

Cell migration requires reorganization of the actin cytoskeleton for the formation of membrane protrusions and a polarized leading edge. This reorganization of the cytoskeleton is known as membrane ruffling and is activated by the polymerization of cortical actin through the ARP2/3 complex and the WAVE protein in a process regulated by RAC1 activity. Given the importance of the Ca2+ ion in migration, in this PhD thesis we have studied the role in the leading edge of the ORAI1 protein, a membrane cannel involved in SOCE (store operated Ca2+ entry). Using the human osteosarcoma cell line U2OS, modified by genomic editing with CRISPR/Cas9, we have observed that cells deficient in ORAI1 show a significant reduction in membrane ruffling and a slowing of cell migration, as well as a decrease in the invasive potential of U2OS cells in the casper zebrafish animal model. Furthermore, our results show that ORAI1 translocates to the plasma membrane and interacts with CTTN, ARP2/3 and CYFIP1, actin nucleationpromoting agents for lamellipodia generation, through a RAC1 activity-dependent mechanism. Finally, we propose a mechanism of SOCE regulation by phosphorylation after observing that inhibition of Thr295 and Ser298 phosphorylation of ORAI1 induces an increase in Ca2+ entry and an enrichment of ORAI1 in intracellular vesicles.