Internalized Amyloid-β (1-42) Peptide Inhibits the Store-Operated Calcium Entry in HT-22 Cells

Abstract

La desregulación de las vías de señalización del calcio desempeña un papel fundamental en el inicio de la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (EA). Las pruebas experimentales acumuladas obtenidas con modelos celulares y animales, así como con muestras de cerebro de EA, señalan la elevada citotoxicidad de las pequeñas formas oligoméricas solubles de los péptidos amiloides β (Aβ) en la EA. En trabajos recientes, hemos propuesto que la complejación A-β calmodulina (CaM) puede desempeñar un papel importante en la señalización neuronal de Ca2+, mediada por proteínas de unión a CaM (CaMBPs). STIM1, una CaMBP reconocida, desempeña un papel clave en la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), y se ha demostrado que la función SOCE está disminuida en la EA, lo que resulta en la inestabilidad de las espinas dendríticas y el aumento de la amiloidogénesis. En este trabajo, demostramos que 2 y 5 h de incubación con 2 μM de oligómeros de Aβ (1-42) en la línea celular inmortalizada de hipocampo de ratón HT-22 conduce a la internalización de 62 11 nM y 135 15 nM de Aβ(1-42), respectivamente. Los oligómeros internalizados de Aβ(1-42) se localizan con el retículo endoplásmico (RE) y co-inmunoprecipitan con STIM1, lo que revela que esta proteína es una nueva diana de Aβ. Las mediciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre STIM1 marcada con una proteína verde fluorescente (GFP) y Aβ (1-42)-HiLyte™-Fluor555 muestran que STIM1 puede unirse a concentraciones nanomolares de oligómeros de Aβ (1-42) en un sitio situado cerca del sitio de unión a CaM en STIM1. El Aβ (1-42) internalizado produce una desregulación de la SOCE en las células HT-22 antes de que pueda detectarse una alteración sostenida de la homeostasis del Ca2+ citosólico, y es provocada por sólo 2 h de incubación con 2 μM de oligómeros de Aβ (1-42). Concluimos que la desregulación de la SOCE inducida por Aβ (1-42) en HT-22 en células HT-22 está causada por la modulación inhibitoria de STIM1 y la activación parcial de los canales de fuga de Ca2+ del RE.

Dysregulation in calcium signaling pathways plays a major role in the initiation of Alzheimer’s disease (AD) pathogenesis. Accumulative experimental evidence obtained with cellular and animal models, as well as with AD brain samples, points out the high cytotoxicity of soluble small oligomeric forms of amyloid-β peptides (Aβ) in AD. In recent works, we have proposed that A-β calmodulin (CaM) complexation may play a major role in neuronal Ca2+ signaling, mediated by CaM-binding proteins (CaMBPs). STIM1, a recognized CaMBP, plays a key role in store-operated calcium entry (SOCE), and it has been shown that the SOCE function is diminished in AD, resulting in the instability of dendric spines and enhanced amyloidogenesis. In this work, we show that 2 and 5 h of incubation with 2 μM Aβ (1-42) oligomers of the immortalized mouse hippocampal cell line HT-22 leads to the internalization of 62 11 nM and 135 15 nM of Aβ (1-42), respectively. Internalized Aβ (1-42) oligomers colocalize with the endoplasmic reticulum (ER) and co-immunoprecipitated with STIM1, unveiling that this protein is a novel target of Aβ. Fluorescence resonance energy transfer measurements between STIM1 tagged with a green fluorescent protein (GFP) and Aβ (1-42)-HiLyte™- Fluor555 show that STIM1 can bind nanomolar concentrations of Aβ (1-42) oligomers at a site located close to the CaM-binding site in STIM1. Internalized Aβ (1-42) produced dysregulation of the SOCE in the HT-22 cells before a sustained alteration of cytosolic Ca2+ homeostasis can be detected, and is elicited by only 2 h of incubation with 2 μM Aβ (1-42) oligomers. We conclude that Aβ (1-42)-induced SOCE dysregulation in HT-22 cells is caused by the inhibitory modulation of STIM1, and the partial activation of ER Ca2+-leak channels.