Secretion of interleukin 6 in human skeletal muscle cultures depends on Ca²⁺ signalling

Abstract

Los efectos sistémicos de la actividad física están mediados por la liberación de IL-6 y otras mioquinas del músculo en contracción. Aunque la liberación de IL-6 desde el músculo ha sido ampliamente estudiada, la información sobre los mecanismos celulares es fragmentaria y escasa, especialmente en lo que respecta al papel de las señales de Ca²⁺. El objetivo de este estudio fue caracterizar el papel de los principales componentes de las señales de Ca²⁺ en las células del músculo esquelético humano durante la secreción de IL-6 estimulada por el agonista movilizador de Ca²⁺ ATP. Se prepararon cultivos primarios a partir de muestras quirúrgicas, se utilizó microscopía de fluorescencia para evaluar las señales de Ca²⁺ y se determinó la liberación estimulada de IL-6 en el medio mediante ELISA. El quelante de calcio intracelular Bapta, el bajo nivel de calcio extracelular y el bloqueador de los canales de Ca²⁺ La³⁺ redujeron la secreción estimulada por ATP, pero no la basal. La secreción fue inhibida por bloqueadores de los canales de Ca²⁺ tipo L (nifedipina, verapamilo), tipo T (NNC55-0396) y Orai1 (Synta66) y silenciando la expresión de Orai1. El mismo efecto se logró con inhibidores de los receptores de rianodina (ryanodine, dantroleno) y de los receptores IP3 (xestospongina C, 2-APB, cafeína). Los inhibidores de la calmodulina (calmidazolium) y la calcineurina (FK506) también disminuyeron la secreción. La transcripción de IL-6 en respuesta a ATP no se vio afectada por Bapta ni por el bloqueador del canal T. Nuestros resultados demuestran que la secreción de IL-6 estimulada por ATP está mediada a nivel postranscripcional por señales de Ca²⁺, incluida la movilización de las reservas de calcio, la activación de la entrada de Ca²⁺ operada por el almacén y la posterior activación de los canales de Ca²⁺ operados por voltaje y las vías de calmodulina/calcineurina.

The systemic effects of physical activity are mediated by the release of IL-6 and other myokines from contracting muscle. Although the release of IL-6 from muscle has been extensively studied, the information on the cellular mechanisms is fragmentary and scarce, especially regarding the role of Ca²⁺ signals. The aim of this study was to characterize the role of the main components of Ca²⁺ signals in human skeletal muscle cells during IL-6 secretion stimulated by the Ca²⁺ mobilizing agonist ATP. Primary cultures were prepared from surgical samples, fluorescence microscopy was used to evaluate the Ca²⁺ signals and the stimulated release of IL-6 into the medium was determined using ELISA. Intracellular calcium chelator Bapta, low extracellular calcium and the Ca²⁺ channels blocker La³⁺ reduced the ATP-stimulated, but not the basal secretion. Secretion was inhibited by blockers of L-type (nifedipine, verapamil), T-type (NNC55-0396) and Orai1 (Synta66) Ca²⁺ channels and by silencing Orai1 expression. The same effect was achieved with inhibitors of ryanodine receptors (ryanodine, dantrolene) and IP3 receptors (xestospongin C, 2-APB, caffeine). Inhibitors of calmodulin (calmidazolium) and calcineurin (FK506) also decreased secretion. IL-6 transcription in response to ATP was not affected by Bapta or by the T channel blocker. Our results prove that ATP-stimulated IL-6 secretion is mediated at the post-transcriptional level by Ca²⁺ signals, including the mobilization of calcium stores, the activation of store-operated Ca²⁺ entry, and the subsequent activation of voltage-operated Ca²⁺ channels and calmodulin/calcineurin pathways.