Length variation of helix III in a hammerhead ribozyme and its influence on cleavage activity

Abstract

The previously described HIV-1 directed hammerhead ribozyme 2as-Rz12 can form with its target RNA 2s helices I and III of 128 and 278 base pairs (bp). A series of derivatives was made in which helix III was truncated to 8, 5, 4, 3, and 2 nucleotides (nt). These asymmetric hammerhead ribozymes were tested for in vitro cleavage and for inhibition of HIV-1 replication in human cells. Truncation of helix III to 8 bp did not affect the in vitro cleavage potential of the parental catalytic antisense RNA 2as-Rz12. Further truncation of helix III led to decreased cleavage rates, with no measurable cleavage activity for the 2 bp construct. All catalytically active constructs showed complex cleavage kinetics. Three kinetic subpopulations of ribozyme-substrate complexes could be discriminated that were cleaved with fast or slow rates or not at all. Gel purification of preformed ribozyme-substrate complexes led to a significant increase in cleavage rates. However, the complex cleavage pattern remained. In mammalian cells, the helix III-truncated constructs showed the same but no increased inhibitory effect of the comparable antisense RNA on HIV-1 replication.

La ribozima de cabeza de martillo 2as-Rz12 dirigida al VIH-1 descrita anteriormente puede formar con su ARN diana 2s hélices I y III de 128 y 278 pares de bases (pb). Se fabricaron una serie de derivados en los que la hélice III se truncó en 8, 5, 4, 3 y 2 nucleótidos (nt). Estas ribozimas de cabeza de martillo asimétricas se sometieron a pruebas de escisión in vitro y de inhibición de la replicación del VIH-1 en células humanas. El truncamiento de la hélice III a 8 pb no afectó al potencial de corte in vitro del ARN catalítico en antisentido 2as-Rz12 parental. El truncamiento adicional de la hélice III condujo a una disminución de las tasas de corte, sin actividad de corte medible para la construcción de 2 pb. Todas las construcciones catalíticamente activas mostraron una cinética de corte compleja. Se pudieron distinguir tres subpoblaciones cinéticas de complejos ribozima-sustrato que se escindieron a velocidades rápidas, lentas o nulas. La purificación en gel de los complejos ribozima-sustrato preformados condujo a un aumento significativo de las tasas de escisión. Sin embargo, se mantuvo el patrón de clivaje complejo. En células de mamífero, las construcciones truncadas en hélice III mostraron el mismo efecto inhibitorio que el ARN antisentido comparable sobre la replicación del VIH-1, pero no mayor.