Effect of cryopreservation on nitric oxide production by stallion spermatozoa

Abstract

The ability of stallion spermatozoa to produce nitric oxide (NO) before (fresh) and after freezing and thawing (FT) was evaluated by means of flow cytometry after loading the sperm suspension with the probe, 4,5-diaminofluorescenin diacetate. The presence of NO synthase (NOS) was investigated by Western blotting using anti-NOS1, anti-NOS3, or anti-universal NOS antibodies (Abs). While NO was detected both in fresh and FT sperm suspensions, its production increased after cryopreservation only when egg yolk was removed from the extender. Anti-NOS1 Ab intensively labeled a single band with an apparent molecular mass of approximately 83 kDa. On the other hand, the Ab developed against the NOS3 showed a band of approximately 96 kDa in fresh and FT sperm lysates. NO production was positively correlated with sperm motility and velocity after thaw, suggesting an NO role for the functionality of cryopreserved stallion spermatozoa; but the production of NO is compromised in egg yolk-containing extenders.

La capacidad de la espermatozoide de semental para producir óxido nítrico (NO) antes (fresco) y después de la congelación y descongelación (FT) se evaluó mediante citometría de flujo después de cargar la suspensión del esperma con la sonda, 4,5-diaminofluorescenin diacetato. La presencia de NO synthase (NOS) fue investigada por la borrado occidental mediante anticuerpos anti-NOS1, anti-NOS3, o antianti-anti-anti-NS (Abs). Aunque NO se detectó tanto en suspensiones de esperma frescas como en FT, su producción aumentó después de la criopreservación sólo cuando se retiró la yema de huevo del extensor. Anti-NOS1 Ab calificó intensamente una sola banda con una masa molecular aparente de aproximadamente 83 kDa. Por otro lado, el Ab desarrollado contra el NOS3 mostró una banda de aproximadamente 96 kDa en lisados de esperma frescos y FT. La producción de NO se correlacionó positivamente con la motilidad y la velocidad de los espermatozés después del deshielo, lo que sugiere un papel de NO para la funcionalidad de espermatozés semental criopreservado; pero la producción de NO se ve comprometida en los extensores que contienen yema de huevo. 2009 por la Sociedad para el Estudio de la Reproducción