Calcium-calmodulin and pH regulate protein tyrosine phosphorylation in stallion sperm

Abstract

The mechanisms leading to capacitation in stallion sperm are poorly understood. The objective of our study was to define factors associated with regulation of protein tyrosine phosphorylation in stallion sperm. Stallion sperm were incubated for 4 h in modified Whitten’s media with or without bicarbonate, calcium, or BSA. When sperm were incubated in air at 30!106/ml at initial pH 7.25, protein tyrosine phosphorylation was detected only in medium containing 25 mM bicarbonate alone; calcium and BSA inhibited phosphorylation. Surprisingly, this inhibition did not occur when sperm were incubated at 10!106/ml. The final pH values after incubation at 30!106 and 10!106 sperm/ml were 7.43G0.04 and 7.83G0.07 (meanGS.E.M.) respectively. Sperm were then incubated at initial pH values of 7.25, 7.90, or 8.50 in either air or 5% CO2. Protein tyrosine phosphorylation increased with increasing final medium pH, regardless of the addition of bicarbonate or BSA. An increase in environmental pH was observed when raw semen was instilled into the uteri of estrous mares and retrieved after 30 min (from 7.47G0.10 to 7.85G0.08), demonstrating a potential physiological role for pH regulation of capacitation. Sperm incubated in the presence of the calmodulin (CaM) inhibitor W-7 exhibited a dose-dependent increase in protein tyrosine phosphorylation, suggesting that the inhibitory effect of calcium was CaM mediated. These results show for the first time a major regulatory role of external pH, calcium, and CaM in stallion sperm protein tyrosine phosphorylation.

Los mecanismos que conducen a la capacitación en el esperma de sementales son poco conocidos. El objetivo de nuestro estudio fue definir los factores asociados con la regulación de la fosforilación de la tirosina proteica en el esperma de semental. Los espermatozoides de sementales se incubaron durante 4 horas en medio Whitten modificado con o sin bicarbonato, calcio o BSA. Cuando los espermatozoides se incubaron en aire a 30.106/ml con un pH inicial de 7,25, sólo se detectó fosforilación de la proteína tirosina en un medio que contuviera 25 mM de bicarbonato; el calcio y la BSA inhibieron la fosforilación. Sorprendentemente, esta inhibición no se produjo cuando los espermatozoides se incubaron a 10!106/ml. Los valores finales de pH tras incubación a 30!106 y 10!106 espermatozoides/ml fueron de 7,43G0,04 y 7,83G0,07 (media GEM) respectivamente. A continuación, los espermatozoides se incubaron a valores iniciales de pH de 7,25, 7,90 u 8,50 en aire o en un 5% de CO2. La fosforilación de la proteína tirosina aumentó con el incremento del pH final del medio, independientemente de la adición de bicarbonato o BSA. Se observó un aumento en el pH ambiental cuando se instiló semen crudo en los úteros de yeguas en estro y se recuperó después de 30 min (de 7,47G0,10 a 7,85G0,08), demostrando un papel fisiológico potencial para la regulación del pH de la capacitación. Los espermatozoides incubados en presencia del inhibidor de la calmodulina (CaM) W-7 mostraron un aumento dependiente de la dosis en la fosforilación de la tirosina proteica, lo que sugiere que el efecto inhibidor del calcio estaba mediado por la CaM.