Focal adhesion kinases and calcium/calmodulin-dependent protein kinases regulate protein tyrosine phosphorylation in stallion sperm

Abstract

Protein tyrosine phosphorylation (PY) is a hallmark of sperm capacitation. In stallion sperm, calcium inhibits PY at pH <7.8, mediated by calmodulin. To explore the mechanism of that inhibition, we incubated stallion sperm in media without added calcium, with calcium, or with calcium plus the calmodulin inhibitor W-7 (Ca/W-7 treatment). Treatment with inhibitors of calcium/calmodulin-dependent kinases, protein kinase A (PRKA), or Src family kinases suppressed the PY induced by the absence of added calcium, but not that induced by the Ca/W-7 treatment, indicating that PY in the absence of added calcium occurred via the canonical PRKA pathway, but that PY in the Ca/W-7 treatment did not. This suggested that when calmodulin was inhibited, calcium stimulated PY via a noncanonical pathway. Incubation with PF-431396, an inhibitor of focal adhesion kinases (FAKs), a family of calcium-induced protein tyrosine kinases, inhibited the PY induced both by the absence of added calcium and by the Ca/W-7 treatment. Western blotting demonstrated that both FAK family members, protein tyrosine kinases 2 and 2B, were phosphorylated in the absence of added calcium and in the Ca/W-7 treatment, but not in the presence of calcium without calmodulin inhibitors. Inhibition of FAK proteins inhibited PY in stallion sperm incubated under capacitating conditions (in the presence of calcium, bovine serum albumin, and bicarbonate at pH >7.8). These results show for the first time a role for calcium/calmodulin-dependent kinases in PRKA-dependent sperm PY; a non-PRKA-dependent pathway regulating sperm PY; and the apparent involvement of the FAK family of protein tyrosine kinases downstream in both pathways.

La fosforilación de la proteína tirosina (PY) es un sello distintivo de la capacitación espermática. En los espermatozoides de semental, el calcio inhibe la PY a pH <7,8, por mediación de la calmodulina. Para explorar el mecanismo de esa inhibición, incubamos espermatozoides de semental en medios sin calcio añadido, con calcio o con calcio más el inhibidor de calmodulina W-7 (tratamiento Ca/W-7). El tratamiento con inhibidores de las quinasas dependientes de calcio/calmodulina, de la proteína quinasa A (PRKA) o de las quinasas de la familia Src suprimió la PY inducida por la ausencia de calcio añadido, pero no la inducida por el tratamiento Ca/W-7, lo que indica que la PY en ausencia de calcio añadido se produjo a través de la vía canónica de la PRKA, pero no así la PY en el tratamiento Ca/W-7. Esto sugiere que cuando la calmodulina está presente en los espermatozoides de sementales, la PY se produce a través de la vía canónica de la PRKA. Esto sugiere que cuando se inhibe la calmodulina, el calcio estimula la PY a través de una vía no canónica. La incubación con PF-431396, un inhibidor de las quinasas de adhesión focal (FAK), una familia de proteínas tirosina quinasas inducidas por el calcio, inhibió la PY inducida tanto por la ausencia de calcio añadido como por el tratamiento con Ca/W-7. El análisis de Western blot demostró que tanto la FAK como la FAK estaban inducidas por el calcio. El Western blot demostró que ambos miembros de la familia FAK, las proteínas tirosina quinasas 2 y 2B, se fosforilaban en ausencia de calcio añadido y en el tratamiento Ca/W-7, pero no en presencia de calcio sin inhibidores de la calmodulina. La inhibición de las proteínas FAK inhibió la PY en espermatozoides de sementales incubados en condiciones capacitantes (en presencia de calcio, albúmina sérica bovina y bicarbonato a pH >7,8).