Evaluación de crioprotectores alternativos, glicerol y antioxidantes en la congelación del eyaculado equino

Abstract

En la actualidad la congelación en el caballo es una técnica ampliamente demandada por la industria equina mundial. Gracias a ésta, es posible almacenar y conservar el material genético de caballos de un alto valor económico, ya sea por sus características morfológicas, importancia genética o los logros deportivos conseguidos. La utilización de esta técnica también se ha visto favorecida, por la supresión de las prohibiciónes impuestas por los libros genealógicos de diferentes razas a la utilización de la IA. Esta modificación de los reglamentos reguladores favorece el comercio internacional de dosis seminales de animales de élite. A pesar de esta situación y de las ventajas que ofrece la utilización de semen congelado, esta técnica no se encuentra exenta de problemas. De forma general, el caballo muestra una elevada variabilidad individual en la respuesta a la congelación de sus eyaculados. Siendo el origen de esta diferente respuesta a la congelación fundamentalmente genético, consecuencia de los esquemas de selección empleados en esta especie. La principal fuente de daños que afecta al espermatozoide equino durante los procesos de congelación y descongelación es el shock osmótico, responsable de la disminución de la viabilidad y fertilidad postdescongelación.

En la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo el diseño y desarrollo de un diluyente de congelación para semen equino, también la comparación de los efectos protectores del glicerol frente a la dimetilformamida y la combinación de ambos agentes. Se evaluó el efecto de la incorporación del hidroxitolueno butilado en el medio de congelación, así como la incorporación del BAPTA-AM como agente quelante del calcio intracelular también en el medio y el efecto sobre los diferentes parámetros espermáticos de la sustitución de medios una vez realizada la descongelación. Finalmente en el último trabajo, investigamos la presencia del TNFα y sus receptores en el espermatozoide equino.

La congelación con el medio Cáceres® diseñado y desarrollado por nuestro laboratorio, mejoró la supervivencia espermática y reducir la variabilidad entre sementales; correlacionamos estos resultados con la reducción del shock osmótico producida por combinación de crioprotectores presentes en el medio. Las muestras congeladas con el medio Cáceres ®, también mostraron un elevado potencial de membrana mitocondrial, pudiendo ser atribuido, también, a la reducción del shock osmótico conseguida con nuestro medio, como en los casos anteriores.

Continuando con el shock osmótico, se conoce que una de las principales fuentes de éste para el espermatozoide equino durante los procesos de congelación y descongelación, es el agente crioprotector permeable incorporado en el medio. Por ello, en nuestro segundo trabajo comparamos los efectos crioprotectores del glicerol frente a la DMF y la combinación de ambos. Los resultados obtenidos en este trabajo, mostraron que los mejores valores de motilidad y velocidad espermática se obtienen con los medios que incorporaban bien la combinación de ambos crioprotectores y por otro DMF al 4% como único agente. Siendo en los dos medios el porcentaje final de crioprotectores del 4%. En el caso de la viabilidad, integridad de membrana y potencial de membrana mitocondrial, los mejores resultados fueron obtenidos empleando el medio que incorpora un 4% de DMF como único crioprotector. Hecho importante es que de los siete sementales utilizados en el trabajo, seis eran considerados como malos congeladores, grupo en el que existe una mayor sensibilidad de sus eyaculados al shock osmótico, de ahí su mejor respuesta a la congelación empleando la DMF como único crioprotector.

Los daños letales y subletales sufridos por el espermatozoide durante el proceso de criopreservación, se relacionan con la peroxidación lipídica de la membrana plasmática. Por ello, en nuestro tercer trabajo, nos pareció importante estudiar el efecto de la incorporación del antioxidante liposoluble BHT en el medio de congelación. Los resultados obtenidos tras esta incorporación, no mostraron mejoras significativas en ninguno de los parámetros evaluados postdescongelación, al incorporar este agente a una concentración de 1 mM en el medio.

En el cuarto trabajo nos propusimos estudiar el efecto de la incorporación en el medio de congelación del quelante intracelular de calcio BAPTA-AM, y posteriormente evaluar el efecto en los parámetros espermáticos de la sustitución del medio tras la descongelación. Los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo, no mostraron efecto alguno de la incorporación del BAPTA-AM sobre la calidad seminal. Mientras que los obtenidos en la segunda parte del trabajo, mostraron una mejora de los parámetros de motilidad y cinética espermática así como del porcentaje de espermatozoides vivos, tras la sustitución del medio que incorporaba el quelante por el medio Tyrodes.

Por último, decidimos estudiar la presencia del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y sus receptores (TNF-R1, TNF-R2), en el espermatozoide equino. Esto se llevó a cabo en muestras de semen fresco y congelado, evaluando de este modo si los procesos de congelación y descongelación afectan a su expresión. En las muestras de semen fresco se detectaron las tres formas del TNFα, mientras que en congelado sólo se detectó la forma soluble además de una reducción de la intensidad de la banda correspondiente a la forma activa del TNFα. En el caso de los receptores, sólo se detectó TNF-R2, siendo esta la primera vez que se observa la presencia de este receptor en el espermatozoide equino.

Nowadays freezing horse semen is a technique widely demanded by the global equine industry. In this way it is possible to store and preserve the genetic material of highly valuable horses, either by their morphology, genetics or athletic achievements. Artificial Insemination (IA) also has been facilitated by the elimination of the ban imposed by the studbooks of different breeds. The new international regulation has facilitated the international trade of semen of elite horses. In spite of the advantages offered by the use of frozen semen, this technique has also several drawbacks. The equine ejaculate shows great individual variability in the response to freezing nd thawing. The origin of this variation is genetic related to breeding criteria not taking in account sperm quality, Thereby the technique has a level of development that can be considered suboptimal. The main source of damage affecting equine sperm during freezing and thawing is osmotic shock.

The present Thesis pursued the design and development of extenders for freezing stallion semen. Also the protective effects of glycerol versus dimethylformamide (DMF) and the combination of both agents were compared. The incorporation of butylated hydroxytoluene in the freezing medium was evaluated as well as the addition of BAPTA-AM as intracellular calcium chelating agent. Finally, in the last paper, we investigate the presence of TNFα and its receptors in equine sperm. The used of fresh and frozen semen lysates allowed to evaluate if cryopreservation induces changes in the expression of TNFα and its receptors.

Cáceres® extender, designed and developed in our laboratory, increased sperm survival and reduced variability among stallions. These results show a correlation between reduced osmotic shock and the combination of these cryoprotectants in the freezing extender. The results also showed a high mitochondrial membrane potential, which may ,as well, be attributed to the osmotic shock reduction achieved with our medium.

It is known that a major cause of osmotic shock for equine sperm during the freezing and thawing process, is the cryoprotective agent itself. Therefore, in our second paper we compared glycerol against DMF and the combination of both. The best values of sperm motility and velocity were obtained with a combination of both cryoprotectants or when using 4% DMF as a single agent. Best results in terms of membrane integrity and mitochondrial membrane potential were obtained when 4% DMF was the only cryoprotectant. These results confirm that the use of the amide reduces the osmotic shock. It is important the fact that six stallions, of the 7 used in this research were considered bad freezers. Group in which there is greater sensitivity of their ejaculates to the osmotic shock are the poor freezers, hence explaining the best response using DMF as the unique cryoprotectant.

Lethal and sublethal damage suffered by the sperm during cryopreservation relate to lipid peroxidation of the plasma membrane. Therefore, in our third paper the effect of the addition of fat-soluble antioxidant BHT in the freezing medium was investigated. The results showed no significant improvement in any of the post-thawing parameters evaluated by incorporating this agent at a concentration of 1 mM in the extender.

In the fourth paper we studied the effect of the incorporation in the freezing extender of intracellular calcium chelator BAPTA-AM and the effect of different media for thawing The results obtained in the first part of the work, showed no effect of the addition of BAPTA-AM on semen quality. The results obtained in the second part of the study showed an improvement of the kinetic parameters and sperm motility as well as the percentage of living sperm, after changing to Tyrode´s media and only in samples incorporating BAPTA-AM.

Finally, we studied the presence of tumor necrosis factor alpha (TNFα) and its receptors (TNF-R1, TNF-R2) in the equine sperm. In fresh semen samples were detected three forms of TNF, while in frozen-thawed sperm only was detected the soluble form and a reduction of the intensity of the band corresponding to the active form of TNFα. In the case of the receptors, only TNF-R2 was detected, being the first time that the presence of this receptor appears in the equine sperm.