Regulación de la diferenciación celular por retrotransposones Alu: modificaciones estructurales en la cromatina e implicación en la maduración de células germinales

Abstract

La accesibilidad de la cromatina define los patrones de expresión espaciales y temporales durante la diferenciación celular. Esta conformación de la cromatina es modulada por retrotransposones, debido a su capacidad de unión a factores de transcripción y otras proteínas asociadas. El proceso a través del cual ocurren estas interacciones a nivel molecular es ampliamente desconocido. Utilizando ensayos de “enhancer blocking”, demostramos que tres retrotransposones “Alu” flanqueantes a los genes de pluripotencia NANOG y OCT4 poseen una elevada actividad aisladora gracias a la unión de AhR (receptor de dioxina) a la secuencia del transposón. Los análisis de marcas de histonas revelaron diferentes patrones de metilación de me3H3K4, me3H3K9 y me3H3K27 dependientes de la expression de AhR, los cuales cambiaban durante la diferenciación por ácido retinoico. Mediante experimentos de captura de la conformación de la cromatina (3C) desvelamos interacciones físicas a larga distancia entre los “Alu(s)” flanqueantes de NANOG. Los resultados obtenidos muestran que la frecuencia de interacción cambia durante la diferenciación, sugiriendo la formación de un bucle de cromatina. Este bucle desaparece con el silenciamiento de AhR, implicando la participación del mismo en el proceso. Para extraer el complejo proteico contenido en el bucle de NANOG, utilizamos una modificación del protocolo CRISPR-Cas9 (enChIP-Cas9), identificando las proteínas asociadas mediante espectrometría de masas. En esta tesis proponemos que los retrotransposones “Alu” regulados por AhR son unos elementos aisladores conservados evolutivamente en el genoma capaces de controlar procesos oncogénicos, de desarrollo y toxicológicos a través de modificaciones de la heterocromatina.

Local chromatin accessibility (CA) defines spatial and temporal gene expression patterns during cell differentiation. This chromatin conformation is modulated by transposable elements (TE), likely because of their ability to bind specific transcription factors (TF) and other associated proteins, becoming insulators and boundaries elements. How these three elements, CA, TEs and TFs are interacting at the molecular level in differentiation processes is largely unknown. By using enhancer blocking assays (EBAs) we report that three “Alu(s)” retrotransposon located in the flanking regions of pluripotency genes NANOG and OCT4 have potent insulation activity conferred by binding the TF dioxin receptor (AhR) to consensus elements present in the transposon sequence. The analyses of histone marks revealed different methylation patterns of me3H3K4, me3H3K9 and me3H3K27 upon AhR expression. Notably, these epigenetic profiles changed during differentiation with retinoic acid (RA). We performed chromosome conformation capture (3C) to address long-range physical interactions between the “Alu(s)” flanking NANOG. The results obtained showed that the interaction frequency changes drastically with RA differentiation, suggesting the formation of a new chromatin loop. Interestingly, such loop disappears by AhR knock-down, implying the involvement of AhR in the process. In addition, to extract the protein complex contained in the NANOG loop without contamination from other regions, we used a modification of CRISPR-Cas9 protocol known as enChIP-Cas9. Then, enChIP-mass spectrometry (enChIP-MS) targeting endogenous loci identified associated proteins. We propose that AhR-regulated “Alu(s)” elements represent evolutionary conserved genome-wide insulators that control developmental, oncogenic or toxicological-dependent processes via physical heterochromatin modifications.