Detection and isolation of RNA-Binding proteins by RNA-Ligand screening of a cDNA expression library

Abstract

A screening assay for the detection of RNA-binding proteins was developed. It allows the rapid isolation of cDNA clones coding for proteins with sequence-specific binding affinity to a target RNA. For developing the screening protocol, constituents of the human U1 snRNP were utilized as model system. The RNA partner consisted of the U1-RNA stem-loop II and the corresponding protein consisted of the 102 amino acid N-terminal recognition motif of the U1A protein, which was fused to β -galactosidase and expressed by the recombinant lambda phage LU1A. Following binding of the fusion protein to nitrocellulose membranes, hybridization with a 32P-labeled U1-RNA ligand was carried out to detect specific RNA-protein interaction. Parameters influencing the specificity and the detection limit of binding were systematically investigated with the aid of the model system. Processing the nitrocellulose membranes in the presence of transition metals greatly increased the signal:background ratio. A simple screening protocol involving a single-buffer system was developed. Specific RNA-protein interaction could be detected in the presence of a large excess of recombinant phages from a cDNA library. Only moderate binding affinities ( K d = 10−8 M) were required. The suitability of the RNA-ligand screening protocol was demonstrated by the identification of new viroid-RNA binding proteins from tomato.

Se ha desarrollado un ensayo de cribado para la detección de proteínas de unión a ARN. Permite el aislamiento rápido de clones de ADNc que codifican proteínas con afinidad de unión específica de secuencia a un ARN diana. Para desarrollar el protocolo de cribado, se utilizaron componentes del snRNP U1 humano como sistema modelo. El ARN asociado consistía en el bucle de tallo II del ARN-U1 y la proteína correspondiente consistía en el motivo de reconocimiento N-terminal de 102 aminoácidos de la proteína U1A, que se fusionó con β-galactosidasa y se expresó mediante el fago lambda recombinante LU1A. Tras la unión de la proteína de fusión a membranas de nitrocelulosa, se llevó a cabo la hibridación con un ligando U1-ARN marcado con 32P para detectar la interacción específica ARN-proteína. Los parámetros que influyen en la especificidad y el límite de detección de la unión se investigaron sistemáticamente con ayuda del sistema modelo. El procesamiento de las membranas de nitrocelulosa en presencia de metales de transición aumentó considerablemente la relación señal:fondo. Se desarrolló un sencillo protocolo de cribado con un sistema de tampón único. Se pudo detectar la interacción específica ARN-proteína en presencia de un gran exceso de fagos recombinantes procedentes de una biblioteca de ADNc. Sólo se requirieron afinidades de unión moderadas ( K d = 10-8 M). La idoneidad del protocolo de cribado ARN-ligando se demostró mediante la identificación de nuevas proteínas de unión viroide-ARN del tomate.