Dynamic microRNA expression profiles during embryonic development provide novel insights into cardiac sinus venosus/inflow tract differentiation

Abstract

MicroRNAs have been explored in different organisms and are involved as molecular switches modulating cellular specification and differentiation during the embryonic development, including the cardiovascular system. In this study, we analyze the expression profiles of different microRNAs during early cardiac development. By using whole mount in situ hybridization in developing chick embryos, with microRNA-specific LNA probes, we carried out a detailed study of miR-23b, miR-130a, miR-106a, and miR-100 expression during early stages of embryogenesis (HH3 to HH17). We also correlated those findings with putative microRNA target genes by means of mirWalk and TargetScan analyses. Our results demonstrate a dynamic expression pattern in cardiac precursor cells from the primitive streak to the cardiac looping stages for miR-23b, miR-130a, and miR-106a. Additionally, miR-100 is later detectable during cardiac looping stages (HH15-17). Interestingly, the sinus venosus/inflow tract was shown to be the most representative cardiac area for the convergent expression of the four microRNAs. Through in silico analysis we revealed that distinct Hox family members are predicted to be targeted by the above microRNAs. We also identified expression of several Hox genes in the sinus venosus at stages HH11 and HH15. In addition, by means of gain-of-function experiments both in cardiomyoblasts and sinus venosus explants, we demonstrated the modulation of the different Hox clusters, Hoxa, Hoxb, Hoxc, and Hoxd genes, by these microRNAs. Furthermore, we correlated the negative modulation of several Hox genes, such as Hoxa3, Hoxa4, Hoxa5, Hoxc6, or Hoxd4. Finally, we demonstrated through a dual luciferase assay that Hoxa1 is targeted by miR-130a and Hoxa4 is targeted by both miR-23b and miR-106a, supporting a possible role of these microRNAs in Hox gene modulation during differentiation and compartmentalization of the posterior structures of the developing venous pole of the heart.

Los microRNAs han sido explorados en diferentes organismos y están involucrados como conmutadores moleculares que modulan la especificación y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario, incluyendo el sistema cardiovascular. En este estudio se analizan los perfiles de expresión de diferentes microRNAs durante el desarrollo cardíaco temprano. Mediante el uso de hibridación in situ de montura completa en embriones de pollo en desarrollo, con sondas LNA específicas para microRNA, se realizó un estudio detallado de la expresión de miR-23b, miR-130a, miR-106a y miR-100 durante etapas tempranas de la embriogénesis (HH3 a HH17). También correlacionamos estos hallazgos con genes diana putativos de microRNA mediante análisis mirWalk y TargetScan. Nuestros resultados demuestran un patrón de expresión dinámica en células precursoras cardíacas desde la veta primitiva hasta los estadios de bucle cardíaco para miR-23b, miR-130a y miR-106a. Además, miR-100 es detectable más tarde durante las etapas de bucle cardíaco (HH15-17). Curiosamente, el seno venoso/tracto de entrada se mostró como el área cardíaca más representativa para la expresión convergente de los cuatro microRNAs. Mediante análisis in silico revelamos que se predice que los distintos miembros de la familia Hox serán blanco de los microRNAs mencionados. También se identificó la expresión de varios genes Hox en el seno venoso en las etapas HH11 y HH15. Además, mediante experimentos de ganancia de función tanto en miocardioblastos como en explantes de seno venoso, se demostró la modulación de los diferentes grupos Hox, Hoxa, Hoxb, Hoxc y Hoxd, por estos microRNAs. Además, se correlacionó la modulación negativa de varios genes Hox, como Hoxa3, Hoxa4, Hoxa5, Hoxc6 o Hoxd4. Por último, se demostró mediante un ensayo de luciferasa dual que Hoxa1 está dirigido a miR-130a y Hoxa4 está dirigido tanto a miR-23b como a miR-106a, lo que apoya un posible papel de estos microRNAs en la modulación del gen Hox durante la diferenciación y compartimentación de las estructuras posteriores del polo venoso en desarrollo del corazón.