Induction of acrosome reaction by 4-Br-A23187 alters the glycoproteomic profile of boar spermatozoa

Abstract

Protein glycosylation is a post-translational modification involved in wide range of biological processes. In mammalian spermatozoa this modification has been identified in numerous proteins, and membrane glycoproteins are involved in the fertilization process. The objective of the present study was to identify changes in protein glycosylation after acrosome reaction (AR) induction using the 4-Br-A23187 ionophore. Our results showed that treatment with 10 μM of 4-Br-A23187 for 20 min significantly increased the percentage of live acrosome-reacted spermatozoa compared to the control (69.8 ± 0.8 vs. 6.4 ± 0.5; mean % ± SEM, respectively). Also, we observed an increase in 32 kDa tyrosine-phosphorylated protein (p32) and a decrease in serine/threonine phosphorylation of the protein kinase A substrates (phospho-PKA-substrates) after ionophore treatment. Furthermore, changes in glycosylated proteins following AR induction were analyzed using different HRPconjugated lectins (GNA, DSA, and SNA), revealing changes in mannose and sialic acid residues. Proteomic analysis of isolated proteins using GNA lectin revealed that 50 proteins exhibited significantly different abundance (q-value < 0.01). Subsequent analysis using Uniprot database identified 39 downregulated and 11 upregulated proteins in the presence of 4-Br-A23187. Notably, six of these proteins were classified as transmembrane proteins, namely LRRC37A/B like protein 1 C-terminal domain-containing protein, Membrane metalloendopeptidase like 1, VWFA domain-containing protein, Syndecan, Membrane spanning 4-domains A14 and Serine protease 54. This study shows a novel protocol to induce acrosome reaction in boar spermatozoa and identifies new transmembrane proteins containing mannose residues. Further work is needed to elucidate the role of these proteins in sperm-oocyte fusion.

La glicosilación de proteínas es una modificación postraduccional que interviene en una amplia gama de procesos biológicos. En los espermatozoides de mamíferos se ha identificado esta modificación en numerosas proteínas, y las glicoproteínas de membrana están implicadas en el proceso de fecundación. El objetivo del presente estudio fue identificar cambios en la glicosilación de proteínas tras la inducción de la reacción acrosómica (RA) utilizando el ionóforo 4-Br-A23187. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con 10 μM de 4-Br-A23187 durante 20 min aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides vivos que reaccionaron al acrosoma en comparación con el control (69,8 ± 0,8 frente a 6,4 ± 0,5; media % ± SEM, respectivamente). Asimismo, observamos un aumento de la proteína tirosina-fosforilada de 32 kDa (p32) y una disminución de la fosforilación de serina/treonina de los sustratos de la proteína cinasa A (fosfo-PKA-sustratos) tras el tratamiento con ionóforos. Además, se analizaron los cambios en las proteínas glicosiladas tras la inducción de AR utilizando diferentes lectinas conjugadas con HRP (GNA, DSA y SNA), revelando cambios en los residuos de manosa y ácido siálico. El análisis proteómico de las proteínas aisladas utilizando la lectina GNA reveló que 50 proteínas presentaban una abundancia significativamente diferente (valor q < 0,01). El análisis posterior mediante la base de datos Uniprot identificó 39 proteínas reguladas a la baja y 11 reguladas al alza en presencia de 4-Br-A23187. En particular, seis de estas proteínas se clasificaron como proteínas transmembrana, a saber, LRRC37A/B like protein 1 C-terminal domain-containing protein, Membrane metalloendopeptidase like 1, VWFA domain-containing protein, Syndecan, Membrane spanning 4-domains A14 y Serine protease 54. Este estudio muestra un protocolo novedoso para inducir la reacción acrosómica en espermatozoides de verraco e identifica nuevas proteínas transmembrana que contienen residuos de manosa. Es necesario seguir trabajando para dilucidar el papel de estas proteínas en la fusión espermatozoide-oocito.