Development of a methodology for estimating the ergosterol in meat product-borne toxigenic moulds to evaluate antifungal agents

Abstract

Los agentes antifúngicos se utilizan comúnmente en la industria cárnica para prevenir el crecimiento de mohos no deseados, como los toxigénicos, en productos cárnicos curado-madurados. Para mejorar la aplicación de antifúngicos se debe evaluar su modo de acción. Su efecto sobre el contenido de ergosterol del moho es uno de los más estudiados, ya que es la diana de algunos antifúngicos comercializados o de aquellos que se encuentran en desarrollo. El objetivo de este estudio fue desarrollar una metodología para determinar cómo actúan los agentes antifúngicos utilizados en la industria cárnica. En primer lugar, se desarrolló un método para analizar el ergosterol mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia acoplada a un detector de matriz de diodos (HPLC-FLD/DAD). Las condiciones cromatográficas optimizadas (gradiente y fases móviles) nos permitieron reducir el tiempo por análisis con respecto a métodos publicados previamente hasta 22 min. De los seis métodos de extracción comprobados, se seleccionó el método 5, que muestra los mejores valores medios de recuperación (99,51%), el menor tiempo de retención (15,8 min) y los valores más bajos de desviación estándar (9,92) y temperatura de trabajo (60◦C). . El límite de detección y el límite de cuantificación fueron 0,03 y 0,1 µg/mL, respectivamente. Todos los parámetros de validación corroboraron la idoneidad del método. Finalmente, se estudió su viabilidad para evaluar el efecto de una preparación antifúngica (AP) comercial y diferentes hierbas que se agregan frecuentemente a los productos cárnicos sobre el contenido de ergosterol de varios mohos toxigénicos. Las diferencias a nivel de cepa se obtuvieron en presencia de AP. Además, la adición de hierbas redujo significativamente el contenido de ergosterol en Penicillium nordicum hasta un 83,91%. Por tanto, la metodología desarrollada es adecuada para evaluar el papel de los antifúngicos en la alteración de la biosíntesis de ergosterol en mohos antes de su aplicación en productos cárnicos reales.

Antifungal agents are commonly used in the meat industry to prevent the growth of unwanted moulds, such as toxigenic ones, on dry-cured meat products. For enhancing the application of antifungals, their mode of action must be evaluated. Their effect on the mould ergosterol content is one of the most studied ones, since it is the target site of some commercialised antifungals or of those that are in development. The aim of this study was to develop a methodology for determining how the antifungal agents used in the meat industry work. A method for analysing ergosterol was firstly developed using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection coupled to a diode array detector (HPLC-FLD/DAD). The chromatographically optimised conditions (gradient and mobile phases) allowed us to reduce the time per analysis with respect to previously published methods up to 22 min. Withing the six checked extraction methods, method 5, showing the best mean recovery values (99.51%), the shortest retention time (15.8 min), and the lowest standard deviation values (9.92) and working temperature (60◦C), was selected. The limit of detection and limit of quantification were 0.03 and 0.1 µg/mL, respectively. All the validation parameters corroborated the method’s suitability. Finally, its feasibility for evaluating the effect of a commercial antifungal preparation (AP) and different herbs that are frequently added to meat products on the ergosterol content of several toxigenic moulds was studied. Differences at the strain level were obtained in the presence of AP. Moreover, the addition of herbs significantly reduced the ergosterol content in Penicillium nordicum up to 83.91%. The developed methodology is thus suitable for screening the antifungals’ role in altering mould ergosterol biosynthesis before their application in real meat products.